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（一）直接法
（1）石蠟切片脫蠟至水，冰凍切片或細胞涂片經丙酮固定10min，PBS洗3min×2次。
（2）滴加0．3％Hz02甲醇液，室溫處理20min，PBS洗3min× 3次（抑制內源性過氧化物酶活性）。
（3）0。l％*37~C消化20min或AR（只限于石蠟片），PBS洗3min×3次。
（4）滴加1：（5～20）正常羊血清或牛血清20min（室溫或37℃），吸去多余血清，不洗。
（5）適當稀釋的酶標記特異性抗體（一抗）孵育60min 37℃，PBS洗3min×3次。
（6）0．04％DAB+0．03％Hz02顯色8—12rain，在光鏡下控制。
（?）充分水洗，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化15～30s。
（8）常規樹膠封片，結果觀察。
（二）間接法
（1）～（3）同直接法。
（4）第二抗體的正常動物血清1：20，室溫20min（阻斷非特異性結合位點），傾去多余血清，不洗。
（5）適當稀釋的特異性抗體（一抗）濕盒37℃中孵育60min，或室溫孵育4h，或4℃孵育過夜，PBS洗3min×3次。
（6）酶標記抗體（二抗）37℃孵育40min，PBS洗3rain×3次
（7）DAB／Hz02顯色8～12rain，鏡下控制。
（8）以下同直接法。
（三）三步酶標間接法
三步酶標間接法是在酶標間接法的基礎上再加一步酶標記三抗，信號進一步放大，使敏感性進一步增加。第三步酶標記三抗必須是抗第二步酶標記二抗，例如第三步酶標記二抗是兔抗鼠，第三步酶標記三抗應該是羊抗兔酶標抗體。另外，第二步和第三步酶標抗體所用的酶必須是同一種酶。
（四）酶標記抗原法
該方法僅用一種特異性抗體，抗體必須過量。其原理是抗體中二個抗原結合位點（二價）分別與組織細胞內的抗原和酶標記抗原結合，原理見圖4—6。該法的zui大的優點是對抗體的特異性和純度要求不高，可以非常穩定地進行IHC的雙重標記，標記二種抗原。
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