揮發性脂肪酸的測定（二）比色測定法

1、測定原理

含揮發性脂肪酸的樣液，在加熱的條件下，與酸性乙二醇作用生成酯，此酯與羧胺反應，形成氧肟酸。在高鐵試劑存在下，氧肟酸轉化為高鐵氧肟酸的棕紅色絡合物，其顏色的深淺在一個較大的范圍內與反應初始物——揮發性脂肪酸的含量成正比，故可用比色法測定。

2、測定方法

⑴ 試劑
① 1：1硫酸：濃硫酸（相對密度1.84，C.P.）加到同體積蒸餾水中稀釋配制。
② 酸性乙二醇試劑：取30.0mL乙二醇(C.P.)與4.0mL配制的稀硫酸混合。
③ 4.5mol/L的氫氧化鈉：稱取180g氫氧化鈉(C.P.)溶于水中，冷后以蒸餾水稀釋至1L。
④ 10%硫酸羥胺溶液：稱取硫酸羥胺(C.P.)10.0g，溶于100mL蒸餾水中。
⑤ 羥胺試劑：量取20.0 mL4.5mol/L的氫氧化鈉，與5.0mL10%的硫酸羥胺相混合。
⑥ 酸性氯化鐵試劑：將20.0g分析純FeCl_{3 ·}6H₂O溶于500mL水中，準確加入20.0 mL濃硫酸，并以蒸餾水稀釋至1L。
⑵ 測定程序
① 乙酸標準液的配制。精確稱取乙酸（分析純，相對密度1.045，含量99.0%）1.010g，以蒸餾水稀釋至100mL，此溶液含乙酸10mg/mL。
準確吸取10 mg/mL乙酸標準溶液1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL、25.0mL、30.0mL，分別置于100.0mL容量瓶內，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得100μL/L、500μL/L、1000μL/L、1500μL/L、2000μL/L、2500μL/L、3000μL/L的乙酸標準系列液。
② 標準曲線的繪制。取相對密度1.045的乙酸（分析純）試劑，制成50mL/L、100 mL/L、500 mL/L、1000 mL/L、1500 mL/L、2500 mL/L、3000 mL/L的系列標準液，分別吸取0.5 mL分置于試管中（12.5cm×1.5cm），每瓶中準確加入，于沸水浴中加熱3min，然后立即以冷水冷卻；再加入2.5mL羥胺試劑，充分搖勻，然后，充分振蕩混勻，以蒸餾水定容，用721型分光光度計以500nm波長測定其光密度，繪制標準曲線，以橫坐標表示濃度值，縱坐標表示光密度值。
③ 樣品的測定。以4000～10000r/min的離心條件，制取沼氣發酵樣品澄清液，吸取0.5mL樣液置于試管中（12.5cm×1.5cm），準確加入1.7 mL酸性乙二醇試劑，充分混合，于沸水浴中加熱3min，應避免試管與加熱器壁直接接觸。然后立即將試管置于冷水中冷卻。加入2.5mL羥胺試劑，并混勻，放置1min，然后全部倒進盛有10mL酸性氯化鐵試劑的25mL容量瓶中，用蒸餾水定容，并充分搖勻，靜置5min，用分光光度計以500nm波長測定光密度。同樣操作做空白試驗1份。       計算