Science：基質(zhì)彈性調(diào)節(jié)培養(yǎng)中的骨骼肌干細(xì)胞的自我更新

       天然存在于成體組織中的干細(xì)胞，如肌肉干細(xì)胞（MuSCs），在體內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)大的再生能力，而一旦培養(yǎng)則會迅速喪失。因此美國和瑞士研究人員P. M. Gilbert等使用生物工程基質(zhì)模擬關(guān)鍵的生物物理和生物化學(xué)微環(huán)境特征，結(jié)合高度自動化的單細(xì)胞跟蹤法，證明基質(zhì)彈性是培養(yǎng)中MuSCs命運(yùn)的強(qiáng)力調(diào)節(jié)因子。與硬塑料（約106 kPa）上培養(yǎng)的MuSCs不同，在模擬肌肉彈性的軟水凝膠基質(zhì)（12 kPa）上培養(yǎng)的MuSCs會在體外自我更新，并且進(jìn)一步移植到小鼠體內(nèi)后，通過wuchuang生物發(fā)光成像進(jìn)行組織學(xué)和定量分析發(fā)現(xiàn)，MuSCs還可廣泛促進(jìn)肌肉再生。再次證明通過模擬生理組織硬度，可實(shí)現(xiàn)成體肌肉干細(xì)胞的繁殖，對未來的細(xì)胞療法有極大啟發(fā)作用。文章以“Substrate Elasticity Regulates Skeletal Muscle Stem Cell Self-Renewal inCulture”為題發(fā)表于SCIENCE。

背景

       許多成體組織含具有明確特征及顯著再生能力的干細(xì)胞。如果干細(xì)胞在分離后立即從一個(gè)個(gè)體移植到另一個(gè)個(gè)體，這種特性將被保留，而治療應(yīng)用中，一旦干細(xì)胞置于平板培養(yǎng)以增加其數(shù)量，這種特性就消失了。當(dāng)移植到小鼠體內(nèi)時(shí)，肌肉微環(huán)境（niche）使新分離的肌肉干細(xì)胞（MuSCs）能廣泛促進(jìn)骨骼肌再生。而標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)塑料板上生長的MuSCs則失去了“干細(xì)胞性”，獲得的祖細(xì)胞再生潛力和治療潛力都大大降低。盡管對生化信號進(jìn)行了廣泛研究，但目前仍無法實(shí)現(xiàn)對包括MuSCs在內(nèi)的培養(yǎng)中的功能性成體干細(xì)胞進(jìn)行繁殖。已知生物物理特性如基質(zhì)硬度可改變培養(yǎng)中細(xì)胞的分化。本研究測試了一個(gè)假設(shè)，即彈性模量在肌肉干細(xì)胞自我更新及其在肌肉再生中的功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)MuSCs培養(yǎng)于模擬肌肉組織硬度的基質(zhì)上時(shí)，可自我更新產(chǎn)生具有修復(fù)受損肌肉潛能的干細(xì)胞，可有助于克服成體干細(xì)胞治療應(yīng)用上的一個(gè)主要障礙。與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）或必須定向分化的胚胎干細(xì)胞不同，該策略利用了具有確定特征和功能的天然組織干細(xì)胞。

結(jié)果

       為模擬肌肉硬度并將生物物理與生物化學(xué)效應(yīng)分離，研究人員構(gòu)建了一個(gè)可調(diào)的聚乙二醇（PEG）凝膠平臺。通過改變前體溶液中PEG的百分比，產(chǎn)生具有一定硬度范圍的水凝膠（圖1A和B），包括模擬成體鼠骨骼肌彈性模量（圖1A和C）。傳統(tǒng)上用于細(xì)胞培養(yǎng)的聚苯乙烯塑料板的彈性模量約3GPa，比骨骼肌硬5個(gè)數(shù)量級以上。層粘連蛋白（laminin）是天然MuSCs微環(huán)境的成分之一，與水凝膠網(wǎng)絡(luò)共價(jià)交聯(lián)并用作粘附配體（圖1B底部）。為確保層粘連蛋白密度及表面化學(xué)在水凝膠和塑料培養(yǎng)條件下保持一致，制作了聚合后不膨脹的凝膠（圖1D），并在塑料表面澆筑一薄層PEG水凝膠（≤1mm），使MuSCs能夠感知到下面塑料的硬度（圖1D）。

       將MuSCs分離并以單細(xì)胞水平分析，柔軟或堅(jiān)硬的培養(yǎng)表面以微孔陣列圖案化（圖1E），因?yàn)榧词挂詿晒饧せ罴?xì)胞分選富集，干細(xì)胞群體也存在內(nèi)在的異質(zhì)性。使用微孔技術(shù)可實(shí)現(xiàn)延時(shí)獲取數(shù)百個(gè)單一干細(xì)胞，但分析由此產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)集很有難度。因此研究人員開發(fā)了高度自動化的算法，稱為Baxter算法(SOM)，它能跟蹤多個(gè)細(xì)胞分裂的譜系關(guān)系。該算法將數(shù)據(jù)分析時(shí)間減少了約90%，錯(cuò)誤率僅為1%。

       通過延時(shí)采集和自動跟蹤建立由單個(gè)細(xì)胞衍生的克隆譜系歷史（圖1E）。與柔軟（99mm/h）培養(yǎng)基質(zhì)相比，在堅(jiān)硬（120mm/h）基質(zhì)上的MuSC速度增加，與已有研究結(jié)論一致。此外細(xì)胞面積隨著細(xì)胞復(fù)制及其內(nèi)容物的增加而增加，并在有絲分裂后回到初始細(xì)胞面積，進(jìn)一步證明了分割參數(shù)的正確。

       在柔軟水凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的MuSCs并不會經(jīng)歷先前培養(yǎng)中報(bào)道的“危機(jī)”或大量死亡。

       培養(yǎng)1周后，軟微孔中產(chǎn)生克隆的細(xì)胞數(shù)量是硬微孔中的2倍。通過Baxter算法可在克隆水平上描述這種現(xiàn)象。在堅(jiān)硬基質(zhì)上，總細(xì)胞數(shù)并不會隨時(shí)間變化，因?yàn)榉至雅c細(xì)胞死亡相抵消；而在柔軟基質(zhì)上，細(xì)胞死亡減少，總細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間增加（圖1G）。兩種情況下細(xì)胞都不會突然死亡，細(xì)胞死亡與時(shí)間和細(xì)胞分裂數(shù)無關(guān)（圖1G）。數(shù)據(jù)證明在軟基質(zhì)上培養(yǎng)可提高M(jìn)uSC存活率。

圖1 柔韌水凝膠提升培養(yǎng)中MuSC的存活率并防止分化。（A）具有可調(diào)機(jī)械特性的PEG水凝膠。楊氏模量（E）與前體聚合物濃度呈線性相關(guān)；紅圈為肌肉彈性。（B）綠色刮刀上的柔韌PEG水凝膠圖像。水凝膠的共聚焦免疫熒光圖像，以將層粘連蛋白微接觸打印于水凝膠微孔底部。（C）流變儀分析脛骨前肌肌肉（n=5小鼠，共10個(gè)肌肉）。（D）不同硬度PEG水凝膠間，凝膠表面蛋白密度沒有顯著差異（E；P＞0.05），為7.6ng/cm2 ± 1.0ng/cm2（n＞4）。（E）Baxter算法分析延時(shí)視頻。有數(shù)百個(gè)含單一MuSCs微孔的水凝膠陣列延遲顯微成像3天。視頻自動加工并分析。（F）單一MuSC（黑色點(diǎn)）在柔軟或堅(jiān)硬培養(yǎng)基質(zhì)上的速度。圓圈表示均速 ± SD（P＜0.0001）。（G）延遲分析期間柔軟（頂部）或堅(jiān)硬（底部）基質(zhì)上總MuSC數(shù)的變化。死亡（X）和分裂（O）。

       基質(zhì)硬度也會影響基因表達(dá)，暗示柔軟表面上的MuSC的干細(xì)胞性得到保留。在柔軟基質(zhì)上培養(yǎng)1周的MuSCs，產(chǎn)生表達(dá)肌生成素（myogenin，分化的MuSCs表達(dá)的肌源性轉(zhuǎn)錄因子）的細(xì)胞，數(shù)量較培養(yǎng)于硬基質(zhì)上的MuSCs多1/3。延時(shí)分析在MuSC最開始分裂或分裂間都沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此排除了細(xì)胞分裂差異導(dǎo)致基因表達(dá)差異的可能性。另外，軟硬基質(zhì)間的分裂率也沒有差異。表明基質(zhì)硬度對培養(yǎng)中的細(xì)胞的分裂率沒有影響，但可能會阻止分化并通過提高生存能力使細(xì)胞數(shù)量增加。

       為證實(shí)柔韌基質(zhì)上培養(yǎng)的MuSCs可保持干細(xì)胞性，體內(nèi)評估了MuSCs的功能。從組成性表達(dá)螢火蟲熒光素酶（Fluc）和綠色熒光蛋白（GFP）的小鼠中分離MuSCs，培養(yǎng)7天。收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)，培養(yǎng)的MuSCs子代移植到免疫缺陷小鼠的脛骨前肌（TA），該小鼠經(jīng)18Gy腿部照射去除了內(nèi)源MuSCs。通過wuchuang體內(nèi)生物發(fā)光成像（BLI）與細(xì)胞數(shù)相關(guān)的熒光素酶活性，定量分析供體細(xì)胞隨時(shí)間的行為（圖2A）。將組織學(xué)檢測到供體源肌纖維對應(yīng)的生物發(fā)光值設(shè)置為植入閾值。這種體內(nèi)功能分析對驗(yàn)證培養(yǎng)的MuSCs的干細(xì)胞性至關(guān)重要。

       體內(nèi)功能分析表明，培養(yǎng)于與肌肉組織生理模量想匹配的基質(zhì)上的MuSCs可zuiyouxiao保持干細(xì)胞性。與之前的報(bào)告一致，塑料上培養(yǎng)的MuSCs植入顯著減少（圖2B）。移植了培養(yǎng)于最柔軟水凝膠上MuSCs的小鼠，生物發(fā)光信號zuiqiang，而移植了培養(yǎng)于最堅(jiān)硬基質(zhì)上MuSCs的小鼠，植入程度和植入率都降低（圖2B）。與組織培養(yǎng)塑料相比，模擬骨骼肌彈性（12kPa）的培養(yǎng)基質(zhì)是weiyi導(dǎo)致小鼠MuSC植入百分比有統(tǒng)計(jì)性顯著增加的條件（圖2C）。

       為確定具有植入潛力的培養(yǎng)細(xì)胞的比例，將MuSCs在柔軟或堅(jiān)硬基質(zhì)上培養(yǎng)1周，隨后稀釋分析。移植了培養(yǎng)于堅(jiān)硬塑料性基質(zhì)干細(xì)胞的小鼠，均未顯示出高于檢測閾值的BLI信號（圖2D紅圈）。相比之下，當(dāng)移植1000個(gè)以上水凝膠（12kPa）培養(yǎng)的干細(xì)胞時(shí)，植入發(fā)生率為baifenzhibai（圖2D黑色圈），與新分離的細(xì)胞類似。僅移植10個(gè)水凝膠培養(yǎng)細(xì)胞的小鼠中，有10%植入（圖2E），與移植10個(gè)新分離細(xì)胞情況的水平（16%）相當(dāng)。

圖2 培養(yǎng)MuSC的植入受基質(zhì)彈性調(diào)節(jié)。（A）體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)方案。（B）受體小鼠移植100個(gè)GFP/Fluc MuSCs后1個(gè)月的BLI值散點(diǎn)圖，MuSCs在不同硬度基質(zhì)上培養(yǎng)7天（左；n=15）。移植了不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞的小鼠的生物發(fā)光圖像（右）。（C）高于植入閾值的BLI值實(shí)驗(yàn)條件的百分比。Fisher’s精確檢驗(yàn)P＜0.05。（D）Fluc MuSCs在水凝膠（黑色）或塑料（紅色）上培養(yǎng)7天，以不同數(shù)量移植1個(gè)月后，受體小鼠BLI值的散點(diǎn)圖。移植了不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞的小鼠的生物發(fā)光圖像（右）。（E）各實(shí)驗(yàn)條件下呈BLI值在植入閾值以上的移植后小鼠的百分比。

       體內(nèi)移植時(shí)，培養(yǎng)于模擬肌肉組織的基質(zhì)上的MuSCs展現(xiàn)出類似新分離MuSCs的動態(tài)增殖行為。兩細(xì)胞群都經(jīng)歷了一個(gè)廣泛的增殖時(shí)期，最終到達(dá)平臺期并穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)動態(tài)平衡（圖3A）。組織學(xué)鑒定GFP+肌纖維來源于再生，是由新分離或培養(yǎng)于柔軟基質(zhì)上的MuSCs再生獲得（圖3B）。盡管新分離的與生長于柔軟基質(zhì)的MuSCs得到的植入率相當(dāng)（圖2C），但培養(yǎng)的MuSCs的植入范圍并不如新分離細(xì)胞那樣強(qiáng)勁（圖3A），表明要體外培養(yǎng)可能還需要額外的生化因素，以涵蓋實(shí)現(xiàn)體內(nèi)zuida功能所需的其他關(guān)鍵微環(huán)境成分。培養(yǎng)于柔軟基質(zhì)的MuSCs一旦移植到肌肉中，可恢復(fù)到其天然的衛(wèi)星細(xì)胞微環(huán)境，這是新分離MuSCs的典型特征。從表達(dá)LacZ（受Myf5啟動子調(diào)控）的小鼠中分離MuSCs并培養(yǎng)于柔軟水凝膠上，隨后移植到小鼠中。收獲組織前，用虎蛇毒素（notexin）破壞受體肌肉，使MuSCs激活并使肌源性轉(zhuǎn)錄因子Myf5表達(dá)上調(diào)。組織學(xué)分析β-半乳糖苷酶染色發(fā)現(xiàn)，與新分離細(xì)胞類似，在基底層之下和肌纖維之上的衛(wèi)星細(xì)胞微環(huán)境中，也發(fā)現(xiàn)了表達(dá)Myf5的移植水凝膠培養(yǎng)細(xì)胞（圖3C）。

圖3 于柔軟水凝膠中培養(yǎng)可促進(jìn)肌肉干細(xì)胞植入及體內(nèi)微環(huán)境重建。（A）通過BLI在移植后30天內(nèi)監(jiān)控新分離（黑線，方塊；500細(xì)胞）、柔韌基質(zhì)（綠線，圓；1500細(xì)胞）、堅(jiān)硬基質(zhì)（紅線，菱形；1500細(xì)胞）上MuSCs的植入。（B）移植新分離（左；500移植細(xì)胞）或柔軟水凝膠培養(yǎng)1周（右；2500移植細(xì)胞）的MuSCs1個(gè)月后，肌肉橫切面免疫熒光檢測GFP表達(dá)。GFP，綠色；層粘連蛋白，紅色；Hoechst，藍(lán)色。（C）免疫組化分析移植了培養(yǎng)于柔軟基質(zhì)MuSCs后1個(gè)月的橫向肌肉組織。箭頭所示為衛(wèi)星細(xì)胞位置的供體源細(xì)胞。β-半乳糖苷酶,綠色；層粘連蛋白，紅色；Hoechst，藍(lán)色。

       干細(xì)胞的典型特征之一是可通過分裂或自我更新獲得更多拷貝。通過一些簡明的體外方法已證實(shí)MuSC培養(yǎng)時(shí)會發(fā)生不對稱和對稱分裂，與自我更新一致。本研究用分離自Pax7-ZsGreen轉(zhuǎn)基因小鼠的MuSCs，體外分析MuSC的基因表達(dá)，表明柔軟的基質(zhì)支持自我更新。觀察到柔軟微孔中，32%的doublets（單個(gè)細(xì)胞分裂產(chǎn)生的兩個(gè)細(xì)胞）呈Pax7（MuSC標(biāo)志物）陽性（圖4A,B）。相反，塑料微孔中只有6%的doublets陽性，表明柔軟基質(zhì)可使MuSC擴(kuò)增。盡管基因表達(dá)數(shù)據(jù)很有提示性，但體內(nèi)功能分析還是必需的，以最終確定培養(yǎng)中發(fā)生了自我更新分裂時(shí)間。

       通過體內(nèi)功能分析確定了干細(xì)胞發(fā)生了自我更新。以細(xì)胞群水平移植MuSC證實(shí)發(fā)生了植入（圖2和3），但并未最終表明培養(yǎng)中發(fā)生了自我更新分裂，因?yàn)榧?xì)胞群中可能含有保持了干細(xì)胞特性的非分裂細(xì)胞。因此本實(shí)驗(yàn)將MuSCs鋪于水凝膠微孔陣列中，并在鋪種細(xì)胞后立即成像，在培養(yǎng)后2-3天成像以識別只含1個(gè)doublet的微孔。用顯微操作器獲取并匯集5個(gè)微孔中的doublets，共10個(gè)細(xì)胞，如此，每只小鼠移植10個(gè)細(xì)胞（圖4A）。可檢測到BLI信號表明5個(gè)移植doublets中至少有1個(gè)發(fā)生了自我更新分裂，實(shí)現(xiàn)了植入。移植了培養(yǎng)于柔軟基質(zhì)doublets的小鼠中，有25%（3/12）可檢測到植入（圖4C），并且促進(jìn)肌纖維再生（圖4D頂部），提供了體內(nèi)功能性證據(jù)，即柔韌基質(zhì)培養(yǎng)的MuSC發(fā)生了自我更新分裂事件。生長于堅(jiān)硬塑料微孔上的doublets移植后從未展現(xiàn)出植入（0/14）（圖4C），表明其再生潛力迅速喪失。

       即使多此分裂后，柔韌水凝膠上的MuSC也會自我更新。將分裂3-5次后的單細(xì)胞生長出的克隆移植到小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植了單克隆的小鼠有12%（1/8）展示出植入，證明柔韌基質(zhì)上培養(yǎng)的MuSC即使多此分裂后依然保持自我更新能力（圖4C，D底部）。

圖4 于柔軟水凝膠培養(yǎng)可促進(jìn)肌肉干細(xì)胞自我更新。（A）體內(nèi)自我更新分析方案。（B）柔軟（n=47）或堅(jiān)硬（n=32）微孔中，展現(xiàn)出Pax7+/+基因特征的doublets的百分比（右）。一個(gè)Pax7+/+ doublet的圖像（左）。天然Pax7-ZsGreen，綠色；Hoechst，藍(lán)色。（C）移植了柔軟（n=12）基質(zhì)或堅(jiān)硬（n=14）微孔中doublets，或柔軟微孔中克隆（n=8）的小鼠的生物發(fā)光值散點(diǎn)圖（左）。生物發(fā)光值在閾值以下的小鼠圖像（右）。（D）移植5個(gè)培養(yǎng)于柔軟水凝膠上的MuSC doublets（頂部，GFP+纖維縱向約13mm）或單個(gè)克隆（底部，纖維縱向約7mm）1個(gè)月后，肌肉橫切面免疫組化檢測GFP表達(dá)。GFP，綠色；層粘連蛋白，紅色；Hoechst，藍(lán)色。

結(jié)論

       本文探究了組織硬度（一種骨骼肌微環(huán)境的生物物理特性）對干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)節(jié)的影響力。通過用單細(xì)胞追蹤算法以單細(xì)胞水平審視MuSC行為，證明了柔軟基質(zhì)可提高M(jìn)uSC存活，防止分化并提升干細(xì)胞性。在小鼠中進(jìn)行的功能性分析最終表明，柔韌基質(zhì)允許培養(yǎng)中的MuSC自我更新。雖然潛在機(jī)制仍有待闡明，但可以假設(shè)硬度的減少改變了細(xì)胞形狀，引發(fā)細(xì)胞骨架重排及信號通路改變，從而保持了干細(xì)胞性。盡管對單一參數(shù)，硬度，干細(xì)胞性可顯著保留，但我們?nèi)云谕ㄟ^將額外的生化線索添加到平臺中來進(jìn)一步增強(qiáng)干細(xì)胞性。利用如本文所述的這種仿生培養(yǎng)平臺進(jìn)行的研究，可在促進(jìn)體外增殖的同事保留干細(xì)胞性以及再生組織的能力，對干細(xì)胞研究具有廣泛影響，也是發(fā)展細(xì)胞療法的關(guān)鍵一步。

參考文獻(xiàn)：

Gilbert  P M ,  Havenstrite R L ,  Magnusson R E G , et al. Substrate elasticity  regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture.[J].  Science, 2010, 329(5995):1078-1081.