生理形態和基質硬度可提高人多能干細胞分化的心肌細胞的收縮能力與成熟度

       心臟作為人體的重要器官，心肌收縮能力對其功能至關重要。心肌細胞（CMs）的收縮活動中斷可能導致各種心臟疾病，同時，以人工手段改變心肌收縮能力也是治療各類心臟疾病的常用方法。通過人多能干細胞分化而來的心肌細胞（hPSC-CMs），由于其易于培養且存活時間長，十分適合作為心肌細胞體外生理模型。然而，未經處理的hPSC-CMs肌原纖維排列混亂，這限制了它們的收縮能力，即對成熟CMs的模擬能力。

       今天，與大家分享一篇發表在PNAS（IF=15.7）上的文章“Contractilityof  single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells  depends onphysiological shape and substrate  stiffness”，作者通過設置不同生理形態與基質硬度改善了hPSC-CMs的收縮能力，減小與成熟CMs之間的差異，并深入研究了促使hPSC-CMs成熟和影響肌節功能的內在因素。

圖1 不同橫縱比hPSC-CMs的Lifeact標記肌動蛋白成像

       在10 kPa(心肌細胞正常基質硬度)聚丙烯酰胺水凝膠中培養橫縱比為1:1、3:1、5:1、7:1的矩形hPSC-CMs，并保持其總面積為2000 μm2。經Lifeact染色后可清晰的看到肌動蛋白(F-actin)在高橫縱比的細胞中有序排列，且隨著長徑比的增加，排列越規整，這將有助于提高hPSC-CMs的收縮性及機械功率。

圖2 牽引力顯微鏡計算zuida牽引力空間分布圖3:1、5:1、7:1、普通hPSC-CMs和1:1 hPSC-CMs (左)，不同橫縱比hPSC-CMs Σ|Fc|的變化圖(右)

       牽引力顯微鏡計算所得的基質牽引力數據顯示橫縱比為7:1的細胞收縮力(Σ|Fc|)zuiqiang，且平均收縮速度與其他hPSC-CMs保持一致，即可知此時hPSC-CMs的機械功率的差異主要體現在收縮力上，二者成正比。隨著橫縱比增大，hPSC-CMs收縮的zuida速度有所增加，表明定形處理有助于提高機械功率與收縮性。在2000  μm2的未定型hPSC-CMs中，其收縮力與1:1的hPSC-CMs相似，而肌原纖維的不規則分布則使其收縮力仍然小于3:1的hPSC-CMs。

圖3  Lifeact標記肌原纖維線掃描成像(左)，每μm肌節的平均收縮力(中)，肌原纖維軸向運動比例(右)

       此外，經過對細胞收縮與舒張長度的測量，橫縱比與肌節收縮的程度成正相關。通過粒子示蹤測速法追蹤F-actin，量化hPSC-CMs在主軸X與副軸Y上的運動情況[u(x)/v(y)]。結果顯示，高橫縱比的細胞在主軸方向收縮能力zuiqiang，這歸因于肌原纖維的大范圍有序排列使得肌節縮短，zuida限度地增加了hPSC-CMs的機械輸出。軸向高度有序的肌原纖維排列也是CMs成熟的一個標志，此時hPSC-CMs可更好的對CMs進行模擬。

圖4 不同細胞形態與基質硬度下收縮力對比(左)，6 kPa下hPSC-CMs 肌原纖維彎曲(中)，35 kPa下肌原纖維部分斷裂(右)

       之后，作者又制備了模擬胚胎心肌(6 kPa)和纖維化心肌(35 kPa)的水凝膠用以研究不同硬度基質下hPSC-CMs的收縮情況。如圖所示，35   kPa下細胞的收縮力zuidi僅為前二者的10%。一般情況下，細胞膜張力隨橫縱比的增加而增大，而胞內張力隨基質硬度增加而增加。此時由于高基質硬度造成了胞內張力超過閾值，大量肌原纖維發生斷裂(25%)，相似的，在6   kPa下，低張力可使肌原纖維產生松弛與彎曲。為了證明張力閾值的存在，通過手動拉伸水凝膠提升細胞膜張力，在拉伸5-10%時細胞力增強約10%，達到14%時肌原纖維開始斷裂，之后細胞停止收縮或收縮力急劇下降。同時，在35  kPa下培養的hPSC-CMs隨著胞外鈣離子(刺激細胞收縮)濃度的增加，肌原纖維斷裂率明顯上升，表明高硬度抑制了細胞收縮性，否則將會有更多肌原纖維斷裂(＞50%)。

圖5 EDTA、諾考達唑、ML-7和BDM處理后hPSC-CMs的變化情況(A)，對應處理后細胞長度變化(B)，肌聯蛋白(titin N2A, N2B)與肌鈣蛋白(TnI, 替恩替)在不同條件下(patterned, glass, 10kPa, 35kPa)的表達情況(下側)

       為了研究胞內張力對肌原纖維的有序排列是否有影響，使用EDTA培養hPSC-CMs以消除其胞內張力，發現肌原纖維的松弛和肌節周期性組織會隨著培養時間的延長而逐漸松弛和消失。之后，利用諾考達唑或細胞松弛素D(抑制肌球蛋白)抑制細胞骨架聚合，或通過其他小分子再次消除胞內張力(ATP酶抑制劑抑制非肌肉肌球蛋白II型與肌動蛋白的結合，ML-7抑制非肌肉肌球蛋白輕鏈激酶，或BDM抑制非肌肉肌球蛋白的ATM酶)。結果顯示只有諾考達唑處理后的hPSC-CMs內部肌原纖維重新有序排列，表明肌球蛋白與肌動蛋白在肌原纖維的有序排列中起到了重要的作用。而后，又測定了肌聯蛋白(titin N2A, N2B)與肌鈣蛋白(TnI, )在不同條件下(是否經過塑形、基底的種類與硬度)的表達情況，結果表明基質硬度和細胞形態可通過調節肌節張力的機制協同調節hPSC-CMs的收縮性。

圖6 7:1和未塑形hPSC-CMs的鈣離子瞬變圖及線粒體分布圖(上側)，電生理測試，定量(q)RT-PCR 測試及暗場橫斷管成像(下側)

       另外，隨著肌節活性的提高，hPSC-CMs的成熟度也進一步的改善。鈣瞬變、線粒體的分布、電生理學特性和橫斷管的形成等都可以顯示hPSC-CMs的成熟情況。如圖所示，在7:1的hPSC-CMs中，鈣離子隨著細胞的收縮而產生軸向移動，而線粒體主要分布于細胞核周圍及細胞兩端，在電生理測試中，膜片鉗記錄處理后的hPSC-CMs具有更低的靜息膜電位、更高的動作電位振幅和更高的zuida上升速率，同時，還可以在hPSC-CMs表面找到沿細胞膜分布的橫斷管結構，這些特征都表明hPSC-CMs與正常的人心肌細胞十分相近。再次體現了其作為體外生理模型的優勢。不過，對單細胞進行的定量(q)RT-PCR結果表明，在基因表達的層面，是否經過pattern處理的hPSC-CMs并未產生明顯的區別。

總結

       本研究表明，在hPSC-CMs中，可以通過調節生理形態和基質硬度來影響細胞張力(調節收縮力，建立和維持肌原纖維排列)，使得肌節縮短并轉化為更高的機械輸出。橫縱比為7:1的hPSC-CMs的肌節活性zuigao且肌原纖維排列zuiwei規整，而收縮能力的增強也表明其更加接近成熟的CMs。同時，經處理后的hPSC-CMs在電生理特性、鈣瞬變、線粒體分布和橫斷管結構的存在與成熟的CMs更為相似。這進一步提升了patterned-hPSC-CMs在體外心臟健康和疾病模型研究中的潛力。

參考文獻:

Ribeiro  A J S , Ang Y S , Fu J D , et al. Contractility of single  cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on  physiological shape and substrate stiffness[J]. Proceedings of the  National Academy of ences of the United States of America, 2015,  112(41).