另辟蹊徑：利用磁性納米顆粒研究iPSC心肌細胞3D球功能反應

       多能干細胞（iPSC）經誘導可分化為心肌細胞（CM），從而產生人心肌的體外細胞模型即iPSC-CM。常規2D培養的iPSC-CM表型通常不成熟。3D培養可提高iPSC-CM的表型成熟度，但通常操作過程復雜，對設備要求高，細胞產量小，研究效率低。來自英國的研究人員Matthew  P.  Burnham等通過添加磁性金-鐵氧化物納米粒可將磁性細胞球精確定位在記錄電極上，并基于此方法研究了共培養、胞外緩沖液成分、電起搏等因素對iPSC-CM的影響。以“A  Scalable Approach RevealsFunctional Responses of iPSC Cardiomyocyte 3D  Spheroids”為題發表在SLAS Discovery上。

研究背景

       成年心肌在細胞層面主要包括表型成熟的心肌細胞（CM）以及緊鄰的心肌成纖維細胞。誘導多能干細胞衍生的心肌細胞（iPSC-CM）為建立成人心肌細胞體外模型奠定了重大研究基礎。但該模型中的iPSC-CM細胞通常表型不成熟，存在具有自發性qiboqi活性但搏動力度不足，肌漿網（SR）鈣（Ca2+）調節發育不*和肌膜離子通道表達不足等缺陷。

       大量研究表明在2D單層細胞培養條件下，iPSC-CM體外表型成熟度會受到限制。而通過模擬各種生理條件如：3D矩陣和結構化支架、與非肌細胞支持細胞共培養、在彈性基層上的電起搏收縮行為和機械調節、以及適當利用能源等均能顯著提高iPSC-CM的表型成熟度。對3D   iPSC-CM功能和結構研究方法很多，如iPSC-CM與非肌細胞支持細胞或細胞外基質蛋白一起形成條狀或環狀，用光學方式追蹤其收縮性；通過在低粘附力表面或在懸滴中培養，iPSC-CM細胞能夠自我組裝形成3D結構，與視頻顯微術相結合也可檢測其收縮性；還有基于染料或光遺傳的報告分子、微電極、多電極陣列或力傳感器等方法來研究3D  iPSC-CM的結構。但這些方法操作過程復雜，對設備要求高，效率極低，導致iPSC-CM產量偏低。

       因此想要進行更高效的iPSC-CM進行研究，我們需要新方法。在低粘附力表面或水凝膠上形成的球狀體/微組織是zuijiandan的獲取iPSC-CM   3D結構的方法，但由此產生的球狀結構處于自由漂浮狀態，跳動活躍難以操作，也難以可靠檢測。本文研究人員通過將iPSC-CM與非肌細胞支持細胞和磁性金-鐵氧化物納米顆粒組裝在一起形成unique共培養細胞球，并使所得的共培養細胞球帶有磁性，能夠被釹磁鐵陣列定向和定位，從而將細胞球精確定位到2D iPSC-CM單分子層功能測量的96孔傳感板的感應電極上（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH），通過記錄收縮力（阻抗）和細胞外場電位（EFP）檢測細胞球生理指標。這是shouci以整板形式進行3D  iPSC-CM功能檢測，同時結合96孔液體處理平臺和聲學分配軟件，實現了高通量操作。為研究3D  iPSC-CM模型是否可以應用于成年心肌的更多生理學研究，研究人員還探究了成纖維細胞共培養（人原代培養的成纖維細胞和小鼠成纖維細胞系）、細胞外緩沖液組成和電起搏等因素的影響，證明該方法具有高效、可擴展性。

結果

       為構建3D iPSC-CM細胞球模型，研究人員向iPSC-CM和成纖維細胞共培養體系中加入金-鐵氧化物納米粒子，形成的磁性細胞球可被磁性陣列吸引并定位到感應電極上，檢測率可達95%以上，且定位附著后的細胞球依然能夠維持良好的3D結構。

圖1. iPSC-CM共培養球形團簇的自組裝及平板陣列的制備。（a）工作流程示意圖，將共培養細胞在超低附著裝配板中與鐵-金納米粒子一起組裝成共培養細胞球，并使用與電極位置對齊的定制磁鐵陣列將球體沉積到記錄電極上，然后將其轉移到傳感器板上（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH）。（b）iPSC-CM細胞在接種后4天內（第1-4天）以iPSC-CM單獨或與成纖維細胞（fb）共培養形式組裝到傳感器板中。（c）釹磁鐵陣列示意圖（尺寸與傳感器板中12×8電極陣列位置相同）。(d)  石蠟切片HE染色表明金-鐵氧化物納米粒子進入球體（白色箭頭），且球中心無壞死。(e)  iPSC-CM球體附著到包被過的傳感板電極4天后，進行中性紅染色，發現3D結構保持良好，并無2D單層細胞出現。

       研究人員對iPSC-CM   3D磁性細胞球模型進行了多項成熟度檢測。通過傳感器阻抗檢測，發現加入金-鐵氧化物納米顆粒并不會改變細胞球的搏動特性，培養2天的細胞球搏動穩定，搏動率為0.8±0.04Hz或49±2.4  bpm，幅度<5 ohm。400 nM異丙腎上腺素（L型Ca2+通道抑制劑）處理后搏動頻率提高，1μM維拉帕米（β-腎上腺素受體激動劑）處理后搏動停止，與已知的藥理學作用一致（圖2，表1）。在給藥方面，研究人員基于96孔液體處理平臺（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH）構建了一種高效配液給藥方法，從培養記錄板中吸出一部分溫熱的培養基，將其與DMSO儲備溶液快速混合，然后再次分配回培養記錄板。該方法操作簡單，用時短，可做到同時給藥且濃度均一，極大地避免了人工操作帶來的各種影響，且給藥期間記錄板中溫度變化在0.5℃范圍內。

圖2   通過阻抗感應檢測iPSC-CM球的收縮參數。(a)單個球收縮和規律搏動時的10s阻抗曲線向下偏轉。(b)搏動特征在較長時間內保持穩定。(c)藍色曲線：400  nM異丙腎上腺素；黑色曲線：1  μM維拉帕米；灰色曲線：對照。(d)c圖的平均數據。(e)使用自動液體操作進行累計添加維拉帕米，產生的濃度-響應數據，n=9次重復。研究人員探究了成纖維細胞共培養對iPSC-CM細胞球的影響。發現與小鼠和人成纖維細胞共培養，iPSC-CM細胞球搏動幅度分別增加約15倍和6倍（圖3a）。代表搏動偏轉的矢量幅度增加了10倍以上（圖3b）成纖維細胞接種比率也影響搏動率。iPSC-CM細胞球的搏動幅度隨人成纖維細胞接種比例的增加而增加，但其搏動幅度隨小鼠成纖維細胞的接種比例增加而降低（圖3c和d，表1）。然而在不同的時間點，不同成纖維細胞的播種比例都會讓iPSC-CM細胞球產生強烈的收縮，表明其收縮力對成纖維細胞本身的存在更為敏感，而不是精確的成纖維細胞接種比率。

圖3  與成纖維細胞共培養可以顯著調節iPSC-CM的固有收縮行為。(a)阻抗記錄表示搏動幅度，iPSC-CM球(CM  only)，小鼠胚胎成纖維細胞共培養球（CM-Fb），原代人成纖維細胞共培養球(CM-hCFb)。(b)光學方法檢測組裝板中的搏動特性，發現成纖維細胞共培養對iPSC-CM搏動幅度有顯著影響，(i,只有iPSC-CM;  ii, MEF共培養)。(c和d)增加人(i或空心正方形)或小鼠(ii或實心正方形)成纖維細胞比例對阻抗傳感搏動幅度和速率的影響。

CM，iPSC-CM細胞球；CM_Nano，含金-鐵氧化物納米顆粒的細胞球；CM_Fb_Nano，含金-鐵氧化物納米顆粒并與成纖維細胞共培養的細胞球。搏動特性以阻抗形式量化。

減少肌膜Ca2+內流的電起搏揭示了肌力反應

       正肌力藥如異丙腎上腺素，通常引起iPSC-CM共培養球體出現變時性反應而不是變力性反應（圖2a），可能反映了與肌膜相比，iPSC-CM共培養球體的肌漿網Ca2+處理能力相對欠發達。通過調整臺氏液中Ca2+濃度減少肌膜Ca2+內流，結合電起搏以控制搏動速率。在這些條件下，100 nM異丙腎上腺素使iPSC-CM共培養球體搏動幅度增大約兩倍（圖4a）。細胞外Ca2+濃度滴定，從1.5 mM開始，表明在0.9 mM或更低的濃度時具有濃度依賴性，在0.6 mM更明顯（圖4b）。本研究未檢查起搏的長期效應，但在0.9 mM Ca2+沒有異丙腎上腺素刺激的情況下，起搏20s后的zuihouyi次搏動較diyi次搏動幅度已經增加了1.24±0.8倍。在對照培養基或1.5mM 臺氏液條件下，這種作用是不存在的（圖4c），這證實了該機制與肌膜Ca2+內流減少有關。盡管iPSC-CM共培養球體的應力-應變關系尚未量化，但鑒于共培養球體彈性系數（剛度）在急性實驗期間保持不變，iPSC-CM共培養球體中的力產生（應力）可以由搏動幅度（應變）的相對變化來表示。與異丙腎上腺素相似，digaoxin（Na+/K+ATPase抑制劑）和xidinafei（5型磷酸二酯酶抑制劑）在基礎條件下均未引起搏動幅度反應的增加。然而，在電起搏或者Ca2+濃度降低的條件下，digaoxin引起明顯的肌力反應（搏動幅度增加1.9±0.5倍），而xidinafei則無正性肌力作用（0.8±0.1倍）。這種情況可能由于digaoxin是一種非β-腎上腺素能機制的正性變力因子，而xidinafei在離體心肌細胞中是通過HCN（超極化激活環核苷酸門控通道）通道被激活起作用的。

圖4 肌力反應受胞外Ca2+濃度和電起搏調節。(a)在含0.6 mM Ca2+的臺式液和1 Hz電起搏條件下，100 nM異丙腎上腺素能夠使搏動幅度(肌力反應)增加。異丙腎上腺素添加前(實線)/后(虛線)。標準化之后搏動曲線寬度變小。(b)在同等搏動條件下對異丙腎上腺素刺激產生的肌力反應要求胞外Ca2+水平低于1.2 mM。(c)含0.9 mM Ca2+的臺式液且無異丙腎上腺素參與條件下，搏動20s之后的振幅(實線)較diyi次搏的動振幅(虛線)有所增加，但在對照組或1.5 mMCa2+臺氏液組并沒有這種現象。(d)正性肌力藥物digaoxin(1μM)能夠引起與異丙腎上腺素類似的波動幅度增加，但磷酸二酯酶抑制劑xidinafei(10 μM)不會產生類似效果。

自主搏動的3D球體中細胞外電位(extracellularfield potentials，EFPs)的檢測

      EFP可以通過記錄自主搏動的iPSC-CM共培養球體來檢測（圖5a）。使用維拉帕米（100 nM）和L型鈣通道激活劑BayK-8644（1 µM）處理，分別導致EFP明顯縮短和延長（圖5b，c），與已知的結果一致。值得注意的是，Bay K-8644處理后出現了明顯的后去極化延遲（delayedafter-depolarizations，DADs）（圖5c），代表肌漿網Ca2+含量超載，導致Ca2+釋放和內向電流的瞬時激活。自主搏動的iPSC-CM共培養球體被檢測到的EFP信號不如阻抗信號強（約為阻抗成功率的50％）。EFP記錄過程中主動收縮力和球體運動的影響尚不清楚，但場電位持續時間（fieldpotential  duration,  FPD）參數的藥理調節已明確建立。加入金-鐵氧化物納米粒子對EFP沒有明顯影響。基礎條件下，在接種后第7天到第20天之間，共從12個傳感器板中的四個獨立批次中的1037個iPSC-CM共培養球體進行定量了EFP和阻抗節拍檢測（圖5d）。iPSC-CM共培養球體的搏動率隨培養時間降低，并且12天后FPD數據的分散性也增加。所有傳感器板的搏動速率和FPD的平均變異率（％CV）值分別為8％和10％。

圖5自主搏動的iPSC-CM共培養球的細胞外電位EFP檢測。(a)對照。(b)100  nM維拉帕米處理。(c)1 μM  Bay-K8644處理。FPD長度以及DAD變化都很明顯。數據來源于接種后7-20天12個獨立記錄板中的1037個成纖維細胞共培養球，檢測EFP和阻抗，表明基線FPD和搏動率都比較顯著。

iPSC-CM和共培養球體的復極機制不同

       與單獨培養的iPSC-CM相比，與小鼠成纖維細胞（MEF）共培養會降低共培養球體的搏動率并略微增加場電位持續時間（fieldpotential  duration, FPD）（BR：41.3±4.7 bpm vs 52.9±6.4 bpm; FPD：0.53±0.06 s vs  0.50±0.07 s）。在短時間內（3-10分鐘）使用的空載體，30nM E-4031（hERG通道抑制劑）或100 µM BaCl2（幾個K+通道的抑制劑，包括Kir2.1）處理發現，共培養球體對E-4031的反應具有時間依賴性且易造成心律失常。在發生心律失常之前，   E-4031短時（3分鐘）分別處理單獨培養的iPSC-CM和共培養球體產生的效應類似，并且FPD升高（圖6），與其他研究一致。在單獨培養的iPSC-CM中，FPD與搏動速率之間的線性關系保持不變，這表明與速率校正后的FPD的偏差與心律失常的發生相吻合。在共培養球體中，FPD明顯偏離了節律喪失前的基線關系。這與加入BaCl2（3分鐘）的反應形成鮮明對比，BaCl2反應在MEF共培養球體中通過增加BR和FPD尺寸而明顯不同（圖6）。共培養球狀體中的BaCl2是增加搏動節律的unique條件。此外，BaCl2的這些作用在原代培養的人心臟成纖維細胞共培養球體（SUPL）中也很明顯。

圖6 iPSC-CM單獨培養和與成纖維細胞共培養的復極化機制。分別用30nM E-4301(綠色)、100 μM BaCl2(紅色)、DMSO對照(藍色)處理后，單獨iPSC-CM球(iPSC-CM，實心)和共培養球(CM+Fb,空心)的FPD與搏動率比較。(a)平均數據。(b) E-4301 散點圖。(c)BaCl2散點圖。BaCl2處理后僅有iPSC-CM單獨培養細胞球搏動率顯著升高，表明不同細胞球中的離子通道表達可能有差異。

總結

       本研究分析了1000多個iPSC-CM共培養球體，實現無標簽測量其收縮性和EFP。結合使用聲學測量和自動處理平臺（CardioExcyte96 platform23 Nanion Technologies GmbH），開發出了高效配藥方法。這些方法適用于對iPSC-CM的3D共培養表型分析，能夠實現高通量處理復雜情況下的iPSC-CM成熟度相關的特征分析。為驗證該方法的有效性和可擴展性，研究人員證明了iPSC-CM與不同來源的成纖維細胞的球狀共培養在某些條件下將其搏動幅度提高了一個數量級。通過降低肌膜Ca2+濃度和電起搏來控制搏動頻率，可以使iPSC-CM通常不存在的正性肌力反應出現，并且在不同機制的正性肌力藥物作用下也可以看到相同效果。最后，與共培養細胞球體相比，iPSC-CM動作電位復極化顯然涉及到不同的離子通道, 包括不同于E-4031反應的BaCl2敏感部分。這些結果清楚表明，iPSC-CM在表型上對3D共培養的球體環境有典型的反應，并且該系統提供了其他優化處理手段（例如細胞類型、長期光遺傳學或電起搏、細胞外基質等）。這種新穎并且簡單的研究方法能夠覆蓋iPSC-CM生理學的多個成熟度相關的檢測分析，并促進了球體共培養模型的進一步開發，該方法可應用于疾病建模，iPSC分化，心血管zhiliao領域或藥物安全性驗證等領域。

參考文獻：

A  Scalable ApproachReveals Functional Responses of iPSC Cardiomyocyte 3D  Spheroids. SLAS Discovery, DOI：10.1177/2472555220975332.