關于層析柱裝柱、使用及相關注意事項

關于層析柱裝柱、使用及相關注意事項

（1）、裝柱前要仔細看填料的使用說明書，每種填料都有自己的特性，以及特殊的裝柱方法，針對不同的空柱，也要注意方法可能不同；

3、這一點非常重要：裝柱包括以后使用中不允許柱內進入氣泡（bubble free），柱頭事先也要排除氣泡。

（2）、填料要加水攪拌成均勻懸液，懸液濃度依填料而不同，一般70－85%，迅速倒入空柱內，或吸或壓，流速和具體步驟看說明書。

（3）、所有柱子盡量做到填料均勻，尤其是用于凝膠層析的柱子。裝柱完成后，可用柱效測定的方法檢查裝填效果。一個裝填合格的柱子的理論塔板高度應是填料平均粒徑的2－4 倍，在此范圍內越小越好。

（4）、選擇合適的泵，首先是流速滿足要求，脈沖盡量小。柱塞泵。

（5）、準備上柱的液體應進行過濾，至少是0.45micrometre。

（6）、關于純化，首先要考慮的是你的目標：純度、數量、速度、收率等等，再根據樣品的具體情況，尤其是目標蛋白的性質，確定純化策略。通常三步曲：capture、purification、polishing。*步先從大量或復雜樣品中將目標蛋白%26ldquo;抓出%26rdquo;，與主要雜質分離；再用高選擇性的層析去除絕大部分雜質；*后精細純化，提供純度至設定目標。到實際工作中，不要死靠三步，也許一步也許四步或更多，具體情況具體分析。所謂%26ldquo;三步%26rdquo;只是一種思路而已。

（7）、至于測序，我想大概不到1mg 應該足夠了。

常壓反相硅膠柱的使用注意事項

C18反相硅膠的預處理很簡單，就是用甲醇浸泡即可。上海五相儀器對其使用作如下說明：使用的時候，將C18反相硅膠用甲醇混勻，攪拌，可以稍微超聲脫氣泡但不可時間太長，5分鐘吧。然后勻漿裝柱，用甲醇沖洗柱子2-3個柱體積，將C18中的交聯劑之類洗掉，然后用你的洗脫劑沖洗主子2-3個柱體積。洗脫劑的選擇可以根據液相也可以根據反相板。如果根據液相的話，需要將液相條件中的有機相減小10%作為洗脫劑為好。然后將你的帶分離物質用洗脫劑溶解，上樣，加洗脫劑沖就可以了。反相硅膠可以反復使用，使用次數增多以后，有可能在柱子頂端產生顏色很深的色帶，可以選擇用丙酮沖洗，如果洗不掉可以選擇將其挖去，然后將主子內C18硅膠保存在甲醇中即可。注意不要甲醇干了。