藍(lán)景科信DAP-seq（DNA親和純化測(cè)序）實(shí)驗(yàn)流程

來(lái)源：藍(lán)景科信河北生物科技有限公司 2021年04月01日 17:37

一、蛋白表達(dá)載體構(gòu)建

1.1. 蛋白表達(dá)載體構(gòu)建試劑

高保真PCR預(yù)混液，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，同源重組克隆試劑盒，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，高純度質(zhì)粒小提試劑盒。

1.2. 蛋白表達(dá)載體構(gòu)建方法

1.2.1. 根據(jù)基因CDS序列，設(shè)計(jì)上游和下游引物并進(jìn)行引物合成。

1.2.2. 使用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取含有CDS序列的質(zhì)粒模板，或者使用客戶提供的質(zhì)粒模板，對(duì)目的CDS進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3. PCR反應(yīng)程序

1.2.4. PCR產(chǎn)物回收
PCR結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒，對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收。PCR產(chǎn)物回收后，測(cè)定回收產(chǎn)物的濃度，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.2.5. PCR產(chǎn)物與蛋白表達(dá)載體的連接轉(zhuǎn)化與鑒定
使用同源重組方法，將目的片段與蛋白表達(dá)載體進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有抗生素的LB培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，對(duì)擴(kuò)增出目的條帶的菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取與測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與CDS進(jìn)行序列比對(duì)。
1.2.6. 蛋白表達(dá)載體的質(zhì)粒提取
對(duì)構(gòu)建正確的蛋白表達(dá)載體，進(jìn)行質(zhì)粒的提取，為后續(xù)蛋白表達(dá)做準(zhǔn)備。

二、基因組DNA的提取
2.1. 基因組DNA提取試劑
根據(jù)不同物種、組織和器官，使用相應(yīng)的提取試劑或者試劑盒。例如：CTAB提取試劑盒、植物通用型提取試劑盒、磁珠法提取試劑盒、含多糖多酚樣本的基因組DNA提取試劑盒。
2.2. 基因組DNA提取方法
2.2.1. 稱取適量樣本材料，液氮速凍，研磨成粉末，使用相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取。
2.2.2. 對(duì)提取的基因組DNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，包括基因組DNA濃度，純度，電泳。

三、親和純化文庫(kù)構(gòu)建
3.1. 親和純化文庫(kù)構(gòu)建試劑
3.1.1. DNA建庫(kù)試劑盒（BIOO SCIENTIFIC，NOVA-5188-01-NEXTflex-Rapid-DNA-Seq-kit-2.0）。
3.1.2. DNA Clean Beads （MICH Scientific，貨號(hào)NGS-0201-100）
3.2. 親和純化文庫(kù)構(gòu)建方法
3.2.1. 取適量基因組DNA進(jìn)行片段化。
3.2.2. 對(duì)片段化后的基因組DNA進(jìn)行篩選。
3.2.3. 取適量片段篩選后的基因組DNA進(jìn)行親和純化文庫(kù)的構(gòu)建，具體方法詳見(jiàn)NOVA-5188-01-NEXTflex-Rapid-DNA-Seq-kit-2.0建庫(kù)試劑盒說(shuō)明書(shū)（BIOO SCIENTIFIC）。
3.2.4. 文庫(kù)構(gòu)建結(jié)束后進(jìn)行質(zhì)檢。

四、體外無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)與檢測(cè)
4.1. 體外無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)的主要試劑
4.1.1. 無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒
4.1.2. 用于進(jìn)行Western Blot檢測(cè)的一抗和二抗。
4.2. 體外無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)反應(yīng)方法
根據(jù)無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)試劑盒的使用說(shuō)明，建立以下反應(yīng)體系，然后25 °C孵育2 h。

4.3. 體外蛋白表達(dá)檢測(cè)

4.3.1. 體外蛋白表達(dá)結(jié)束后，取適量反應(yīng)液，進(jìn)行SDS PAGE和Western Blot，檢測(cè)有無(wú)目標(biāo)蛋白的特異性條帶。

五、蛋白質(zhì)與文庫(kù)的親和純化

5.1. 親和純化所需要的主要試劑和設(shè)備

5.1.1. 親和純化磁珠

5.1.2. 平衡緩沖液

5.1.3. 24孔磁力架（Mich Scientific，貨號(hào)Magpow-24）

5.2. 親和純化方法

5.2.1. 將平衡好的磁珠與平衡緩沖液混勻。

5.2.2. 將蛋白表達(dá)預(yù)混液與磁珠充分混勻后進(jìn)行孵育。

5.2.3. 向上述混合液中加入適量文庫(kù)后充分混勻后進(jìn)行孵育。

5.2.4. 洗滌非特異性結(jié)合DNA，洗脫特異性結(jié)合的DNA。

六、洗脫文庫(kù)擴(kuò)增質(zhì)檢與測(cè)序

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