血液分子生物學檢驗技術及臨床應用

血液分子生物學檢驗技術主要包括PCR技術、DNA測序技術、限制性片段長度多態性（RFLP）、轉基因技術及基因芯片（DNA-chip）技術等分子生物學技術。目前這些技術已應用于血液病基因分析、基因診斷、白血病分型、指導治療、判斷預后和微小殘留病檢測等方面。

（1）核酸分子雜交技術原理和方法

1）Southern印跡雜交

2）Northern印跡雜交

3）核酸原位雜交

（2）聚合酶鏈反應原理和常用PCR產物檢查方法

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術于1985年由美國Mullis等建立。PCR技術使體外擴增核酸片段成為可能，使人們能夠在幾小時內從試管中獲得大量特異核酸片段。由于核酸是生物體儲存和傳遞遺傳信息的載體，因此能夠迅速獲得大量特異核酸片段的PCR技術給生命科學各個領域的研究手段帶來了革命性的變化。該技術已經與DNA克隆、DNA重組和DNA測序等技術一樣成為血液分子生物學一項*的工具。
1）PCR產物檢測

①瓊脂糖凝膠電泳

②Southern印跡雜交

③斑點雜交法

④PCR-ELISA法

⑤原位雜交法

（3）以PCR為基礎的相關技術

近年來PCR技術在應用的過程中得到了進一步的發展。目前已出現多種以PCR為基礎的PCR相關技術，形成了適用于不同目的的PCR技術系列，以下是幾種在血液學及檢驗領域應用較多的PCR相關技術。

1）逆轉錄PCR

逆轉錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是以細胞內總RNA或mRNA為材料進行的體外擴增技術。由于耐熱的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作為模板，因此必須先將總RNA或mRNA作逆轉錄，生成與之互補的cDNA，然后再以cDNA作為模板進行PCR擴增，得到所需要的目的基因片段。RT-PCR常用于克隆cDNA、合成cDNA探針以及分析基因表達等。

2）定量PCR

zui初的PCR技術只是用于定性檢測DNA或RNA，對PCR產物的數量并不重視。隨著科學研究的逐步深入，人們開始考慮用PCR技術來進行DNA或RNA的定量檢測，隨之出現了定量PCR（quantitative PCR，Q-PCR）技術這一新名詞。目前常用的Q-PCR技術可分為終點法和實時法。

3）多重PCR

多重PCR（multiplex PCR）即在同一反應體系中加入多對引物，以同時擴增一份DNA樣品中多個不同序列的靶片段。多對引物間的組合必須滿足二個條件，一是將反應條件較為接近的引物組合在一起，以使該反應條件能盡量適合所有被擴增片段，二是同一反應內各擴增片段的大小應不同，以便檢測時能通過電泳將各片段分離開。多重PCR比較適用于被檢測基因較大，突變點較多的基因。

4）差異顯示PCR
差異顯示PCR（differential display PCR，DD-PCR）是一種以逆轉錄PCR為基礎的研究基因表達差異的技術?；蛟诓煌M織細胞中的表達不同，在細胞的不同發育階段和狀態中的表達也有差異。研究基因表達譜的變化有助于理解細胞分化、增殖、細胞周期的調節和細胞衰老、凋亡的過程。

5）原位PCR

原位PCR（in situ PCR）是指組織固定處理細胞內的DNA或RNA，并以其作為靶序列進行PCR反應的過程。原位PCR與普通PCR的主要區別在于模板的制備。經脫蠟處理的組織切片或細胞懸液均可作為擴增樣品，所有反應在載玻片上進行。原位PCR技術不僅不需要從組織細胞中分離模板DNA或RNA，而且能在細胞原位進行PCR擴增，大大地提高了檢測的靈敏度。目前，原位PCR已成為研究靶基因序列的細胞定位、組織分布和基因表達檢測的重要手段。

（4）基因芯片技術

基因芯片技術又稱DNA微陣列（DNA - chip）。該技術是二十一世紀生命科學領域廣泛應用的一項快速的分子生物學技術。DNA-chip是將大量以特定排列方式的基因探針或基因片段固定于硅片、玻片和塑料片上，樣品DNA或RNA通過PCR擴增，體外轉錄等技術摻入熒光標記分子，與微陣列雜交后再通過熒光掃描儀及計算機分析，即可獲得樣品大量基因序列及表達信息。目前，基因芯片技術主要應用于白血病的免疫分型、細胞的基因表達檢測、基因異常檢測及單核苷酸多態分析等。

（5）分子生物學檢查在血液學中的應用

1）惡性血液病融合基因的檢測

白血病染色體相互易位是導致染色體重排的zui常見原因。染色體重排在分子水平上常形成融合基因。重組產生的融合基因及其融合蛋白是疾病的特異性分子標志。融合基因檢測對疾病的診斷、分型、治療方案的選擇、預后判斷及微小殘留病的檢測都有重要的意義。
慢性粒細胞白血?。–ML）Ph 染色體易位的后果是使位于9q34上的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因上，形成BCR-ABL融合基因，表達一個具有高*激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，后者是CML發病的分子基礎。
急性早幼粒細胞白血病（APL）特異性染色體易位是t（15；17）（q22；q21），易位的結果使15號染色體的PML原癌基因與17號染色體上的維甲酸受體a（RARa）基因融合產生PML-RARa融合基因。臨床上變異型APL（M3v，M3b）與急性粒細胞白血病部分分化型（M2）較難鑒別，M2的t（8；21）可產生一種融合基因AML1-ETO，這種融合基因在M2中的發生率為20％-40％，在M2b中可達90％，通過融合基因的檢測可準確鑒別這兩種白血病。融合基因的檢測對治療方案的選擇有明確的指導作用，在ATRA和*達*緩解（CR）的M3，PML-RARa融合基因陽性者極易在十個月內復發，而融合基因陰性者，復發率低。

2）免疫球蛋白重鏈（IgH）基因和T細胞受體（TCR）基因重排的檢測　IgH和TCR的編碼基因具有多態性。IgH基因重排是產生個體多樣性和*性的主要原因。由于白血病細胞源于造血干細胞，所以白血病細胞是單克隆性的。用PCR方法對重排基因進行擴增，正常白細胞的擴增產物大小不等，呈模糊的階梯狀，而白血病細胞擴增產物經電泳后條帶是單一的。約80%的B淋巴細胞白血病可檢測到IgH基因重排。通過PCR方法檢測IgH和TCR基因重排，有助于急性淋巴細胞白血病的分型以及微量殘留的檢測。

3）遺傳性血液病的診斷　血紅蛋白病是常見的遺傳性溶血性疾病，血友病是常見的遺傳性出血性疾病?；蛉毕莅ɑ蛉笔?、點突變、插入、倒位等。對于基因重排，可通過RT-PCR進行檢測；對于點突變則可用PCR結合酶切位點分析，即當點突變使某一酶切位點消失或在某一區域出現新的酶切位點時，可用該酶切點兩側的引物進行擴增，然后將擴增產物用適當的內切酶切割，根據電泳圖譜來判斷有無內切酶切點的改變。對于與限制性內切酶點無連鎖的點突變，則可采用PCR結合特異寡核苷酸探針（ASO）斑點雜交法進行診斷。

4）HLA基因多態性檢測　采用PCR擴增產物的反相雜交（斑點雜交）進行HLA基因多態性檢測十分簡便、有效。將每個位點的所有寡核苷酸探針固定在固相支持物上，引物先經*化后，進行待測DNA的基因擴增，從而得到*化的DNA放大產物。用此產物與膜上的探針雜交，然后進行顯色或化學發光。這樣每個樣本只需雜交一次即可完成。此方法適合骨髓移植的HLA基因配型及HLA基因與疾病相關性分析等。

5）腫瘤細胞多藥耐藥基因的檢測　多藥耐藥性（multidrug 　resistance,　MDR）是指腫瘤細胞接觸了一種藥物以后，不但對該藥產生耐藥性，而且對其他結構的作用機制不同的藥物也產生耐藥性。研究發現，MDR的出現常與多藥耐藥基因（MDR1）過度表達有關，目前已建立Northern印跡法、斑點和狹縫印跡法、RT-PCR法及原位雜交法，從mRNA水平對患者進行測定，了解腫瘤細胞的耐藥特性。有研究表明，急性髓細胞白血病MDR1的表達與預后有密切相關，即MDR1陽性者CR率低，生存期短，且易早期復發。

6）基因治療　基因治療的目的是應用DNA重組技術和基因轉移技術，把野生型的基因導入患者體細胞內，成為正常的基因產物，來補償缺陷基因的功能，從而使疾病得到糾正。目前認為基因治療的靶細胞是造血干細胞或間質干細胞等。常用的載體是逆轉錄病毒和腺病毒。采用含人因子Ⅸ基因逆轉錄病毒載體轉染血友病B患者的原代皮膚成纖維細胞，使其表達一定濃度的因子Ⅸ，這將為血友病B治療提供新的方法。