從3D類器官到單細胞——珀金埃爾默邀您參加2020中國細胞生物學會年會

來源：珀金埃爾默企業管理（上海）有限公司 2020年07月22日 17:12

細胞的3D模型培養能夠更好地模擬微環境、細胞間相互作用和體內生物過程。相較于生化檢測和2D模型，3D模型可提供更具生理相關性的條件。此外，其形態學和功能分化程度更高，這也賦予了它們更接近體內細胞的特征。如今越來越多的研究人員正在應用3D細胞培養、微組織和類器官技術來填補2D細胞培養與體內動物模型之間的差距。特別是類器官的研究和使用，類器官（Organoid）是源自干細胞的體外衍生3D細胞聚集體，具有類似器官結構和功能。近年來，3D類器官培養技術逐漸成熟，正在成為藥物篩選、個性化治療和發育研究的重要模型。

然而，細胞的3D培養技術面臨著諸多挑戰：首先，培養一致的、可再現的3D 微組織十分困難，尤其是類器官的培養；此外，大而厚的細胞樣品成像難度*；同時，處理3D細胞實驗產生的海量數據則是嚴峻的挑戰。

針對3D微組織樣品，使用傳統的冰凍切片染色成像或直接使用共聚焦顯微鏡進行成像都有很多挑戰：冰凍切片成像無法獲得立體樣品的全部信息，特別是Z軸的細胞位置信息；共聚焦顯微鏡有較高的光毒性和光漂白，不能對立體樣品反復多層的成像，成像的層數有很大限制；此外，這兩種拍攝方法獲取的大量圖片還需借助其他分析軟件對其數據進行分析和統計，分析通量很低；重要的是，這兩種方法掃描速度都很慢，通量很低，一個3D微組織的掃描分析時間長達幾個小時，極大的限制了3D微組織研究的開展。

高內涵細胞成像能夠在保持細胞結構和功能完整性的前提下，對細胞和亞細胞層次進行多通道、多靶點的熒光全面掃描，檢測細胞形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導等各個環節，在單一實驗中獲取大量相關信息。在細胞凋亡、細胞周期、細胞毒作用、受體蛋白轉位、蛋白相互作用等方面都有很好的應用，被證明是細胞生物學，癌癥研究，病原生物學，藥物研發，系統生物學，心血管疾病研究，干細胞研究，神經細胞研究等領域的重要研究工具。

PerkinElmer公司提供的高內涵細胞成像分析系統，它采用Nipkow轉盤掃描技術配以高靈敏度sCMOS探測器，能夠快速捕捉到細胞內發生的生物學過程，更因其降低光漂白和光毒性的特點，配合水浸式高數值孔徑物鏡，可以實現對活細胞、小型模式生物和3D微組織樣品進行高通量的共聚焦高分辨率成像。再結合強大的Harmony分析軟件，能夠對細胞和亞細胞層面各種復雜的表型進行群體性統計分析研究。該系統在細胞生物學研究領域有著非常廣泛的應用。

PerkinElmer高內涵系統的3D方案不僅僅局限于3D微組織，包括模式生物、細胞偽足等立體結構都可以通過高內涵系統完成全面的檢測和分析：

珀金埃爾默的單細胞ICP-MS技術，基于業界快的的細胞脈沖信號讀取速度（可達100000點每秒），能定量單個細胞中低至阿克級別的金屬和納米顆粒含量，測定細胞群中金屬質量分布和含金屬細胞的數量，從而評估與量化細胞群的異質程度。適用于人體、動物、植物等各種組織器官細胞的深入研究。

例如，含金屬藥物和納米顆粒越來越廣泛的應用于癌癥的治療和檢測，單細胞ICP-MS可進行精細跟蹤，掌握病變組織在細胞層面上對藥物的吸收和代謝，有助于了解癌癥機理和提升治療水平。

兩株卵巢癌細胞系A2780（順鉑敏感型）和A2780/CP70 （順鉑耐藥型）隨時間變化順鉑攝入量

生物體中的銅含量通過非常有效而復雜的穩態機制得以嚴格調控，該機制可控制元素的吸收、分布和排出。目前數據得到的細胞銅穩態模型只是一“骨架” ，用SC-ICP-MS來測量外周血單核細胞（PBMC）中的銅（Cu）含量，對了解穩態機制的失調或失衡可能導致生物體功能異常，并可能與某些疾病（例如炎癥、哮喘、衰老過程、癌癥等）方面提供了進一步研究的有效手段。

外周血單核細胞（PBMC）中銅的含量

應用領域舉例：

3D微組織類器官目前的應用主要集中在腫瘤研究（藥篩模型、藥篩、腫瘤免疫、個體化醫療）、干細胞和發育生物學、體外模型研究（感染模型、毒性評價）、材料及給藥研究等方面：

腫瘤研究

2019年6月17日，Cell Death and Disease雜志在線發表了錢其軍研究組的研究成果Modified CAR T cells targeting membrane proximal epitope of mesothelin enhances the antitumor function against large solid tumor。該工作致力于優化腫瘤CAR T免疫療法。

MSLN（Mesothelin，間皮素）是嵌合抗原受體（CAR）T治療的誘人抗原，MSLN中的表位選擇至關重要。在這項研究中，作者使用修飾的piggyBac轉座子構建了兩種針對MSLN的I區（meso1 CAR，也稱為膜遠端區域）或MSLN的III區（meso3 CAR，也稱為膜近端區域）的兩種類型的CAR系統。其中，meso3 CAR T細胞在激活后表達更高水平的CD107α，并在體外針對表達多種MSLN的癌細胞產生更高水平的白介素2，TNF-α和IFN-γ。

之后，作者構建了胃癌和卵巢癌3D腫瘤細胞模型，并用該模型來測試這兩種CAR T系統，通過PerkinElmer Opera Phenix高內涵系統完成3D腫瘤 CART殺傷系統的成像和分析，終證明在3D細胞水平，meso3 CAR T細胞比meso1 CAR T細胞具有更高的殺傷作用。

后續的研究中，作者借助PerkinElmer Xenogen IVIS成像系統，在胃癌NSG小鼠模型中進一步進行驗證，同樣證明與meso1 CAR T細胞相比，meso3 CAR T細胞介導的抗腫瘤反應更強。我們進一步確定meso3 CAR T細胞可以有效地抑制體內大卵巢腫瘤的生長。

總體而言，本研究證明meso3 CAR T細胞療法在治療MSLN陽性實體瘤方面比meso1 CAR T細胞療法具有更好的免疫療法，為實體瘤的免疫治療提供了新的有效的CAR T療法。

干細胞與發育生物學

2018年11月，英國的格拉斯哥大學癌癥科學研究所在Nature Communication雜志發表了名為《The Phospholipid PI(3,4)P 2 Is an Apical Identity Determinant》的文章，本文主要以MDCK囊腫為模型，研究了上皮細胞的極化機制，終發現PI(3,4)P2磷脂酶是決定上皮細胞極化發生的重要分子，并闡明了其調控機制。

在本文中，作者首先發現磷酸酯修飾酶PI(3,4)P2的分布在上皮細胞極化的過程中是至關重要的，接下來，他們用PI(3,4)P2的分布作為表型，篩選哪些蛋白的敲除影響其分布。該過程是通過PerkinElmer的Opera Phenix高內涵系統來實現的，作者先通過高內涵系統的預掃描成像功能對微球進行智能的層切式掃描，選取橫截面大的那一層，然后把細胞分區域，分細胞核、細胞質、內側、外側和細胞連接處等等，然后計算每個區域的熒光強度。作者使用此方法去分析一些突變過的微球的磷脂酶分布，發現一些重要的上游蛋白（如PIP蛋白）被敲掉后，會發生顯著的定位變化。

除此以外，作者還利用高內涵系統分析了微球的空腔表型，MDCK囊腫包含多少個空腔直接反映了其功能是否正常，只有極化正常發生的囊腫才能有正常的空腔。同樣的，作者使用高內涵預掃描成像功能對所有球做了層切式掃描，選取有空腔的這些層，把它們壓到一起，然后通過算法選出空腔，分析其數量。作者也用該方法做了一系列基因的篩選，篩選到幾個顯著影響空腔形成的基因，并在后續闡明了其調控機制。

體外模型研究——肝損傷模型

2018年，王韞芳課題組在新刊Advanced Biosystems雜志上發表封面文章，研究展示一種新型的藥物性肝損傷研究模型——LBS微肝球模型(Liver biomatrices scaffolds, LBSs)。該模型在HepaRG細胞的基礎上引入天然脫細胞肝臟支架，可進行肝細胞的長期3D培養。在LBS提供的肝組織特異微環境下，新模型具有更高的生理相關性和毒理預測敏感度。

作者使用PerkinElmer Operetta CLS 高內涵篩選系統，深入評估了8種抗抑郁藥物的肝毒性。結合特定的染料組合，從細胞活力、凋亡、膽汁蓄積、脂肪變、氧化應激和線粒體毒性6個方面檢測藥物處理對微肝球模型的影響。其中的許多參數都使用了復雜的高內涵分析方法。結果證明LBS微肝球模型能高度特異預測藥物肝毒性和協助進一步的毒理機制研究。

本研究還用到了PerkinElmer的Engisht多功能成像酶標儀，研究利用Alamar blue法追蹤不同培養條件下細胞活力的變化。

PerkinElmer提供的分子及細胞水平檢測方案貫穿本論文藥物肝毒性研究的整個過程。從微肝球模型的細胞增殖、酶活分析，再到3D模型的功能驗證和毒理學多指標分析，PerkinElmer均能提供針對性的應用方案。

材料及給藥研究

2019年6月，愛爾蘭都柏林大學學院生物與環境科學學院&康威研究所在Small雜志發表名為《A High‐Throughput Automated Confocal Microscopy Platform for Quantitative Phenotyping of Nanoparticle Uptake and Transport in Spheroids》的文章。該研究利用PerkinElmer高內涵Opera Phenix系統，構建了完整的在3D微組織層面研究納米載體攝取和運輸的模型。

作者首先進行3D微組織培養和高內涵拍攝的優化，主要研究了培養條件和固定方法對不同濃度的基質膠的影響，并根據該實驗結果確定了培養方法、固定方法和基質膠濃度及用量。

此外，作者也通過順式到反式高爾基標記物(GM130、GalT和TGN46)的分布染色考察了高內涵的拍攝質量，證明PerkinElmer高內涵系統確實有*的分辨率，用來研究納米顆粒的攝取情況是足夠的。

接下來，作者通過Harmony軟件對層切掃描圖片進行重構分析，獲取大亮度投影和3D重構視圖，在此基礎上定量測量球狀體中NP吸收和滲透。

后，作者選擇了在納米顆粒胞吞作用中有功能的蛋白，通過RNAi沉默進行潛在基因篩選，確定該模型可用于評估3D微球NP的攝取和運輸過程。

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