RNA pulldown步驟方法

RNA結合蛋白(RBPs)在轉錄后水平調節基因的表達起著重要的作用，具體的作用包括mRNA前體的剪接、多腺苷化和穩定性的維持，mRNA從細胞核向細胞質的運輸，mRNA的定位和翻譯等。RBPs在這些過程中的調節作用是通過結合新合成的或者成熟后的轉錄物的特定序列實現的。于此同時，有很多RBPs能夠識別RNA中的特定核苷酸序列。
RNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步驟：S1、磁珠預處理：使用BSA和寡核苷酸隨機引物封閉鏈霉親和素標記的磁珠；S2、制備探針?磁珠復合物：將步驟S1預處理的磁珠與*標記的RNA探針結合；S3、提取并預處理細胞全蛋白：向提取的細胞全蛋白中加入脫氧核糖核酸酶孵育，再加入未預處理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown：將步驟S3收集的上清加入到步驟S2制備的探針?磁珠復合物中，加入脫氧核糖核酸酶抑制劑和核糖核酸酶抑制劑孵育，收集磁珠，用含核糖核酸酶抑制劑的NT2 buffer洗滌磁珠，得到蛋白?探針?磁珠復合物；S5、RNP的收集：將步驟S4制得的蛋白?探針?磁珠復合物加入Urea CHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得RNP。