人源細胞培養(yǎng)操作規(guī)程

人源細胞處于未分化狀態(tài)：ES細胞培養(yǎng)用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預(yù)先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。
培養(yǎng)基：ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。
注：一瓶DMEM是500ml。
貯存液：DMEM（高糖）、馬血清（HS）、L-*（200mM）、MEM NEAA（10mM）、HEPES（1M）、β-巰基乙醇（55Mm）、PEST、ESGRO。

復(fù)蘇細胞：細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復(fù)蘇是很重要的。
操作步驟：
1．從液氮中取出一管細胞；
2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好*溶解）；
3．將細胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；
5．離心3分鐘；
6．棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞，至少吹打10次；
7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；
8．孵育。
凍存細胞
人源細胞凍存液：90％HS和10％二甲基亞砜
步驟：
1．1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；
2．用細胞刀收集細胞；
3．將細胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘；
4．棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中（10cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml。）
5．分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml；
6．置－80℃過第二天移入液氮。
"分子式: C27H30O15 
分子量:594.52 "    Oroxin B    20mg/支    木蝴蝶苷B
94079-81-9    Poliumoside    20mg/支    金石蠶苷
"分子式:C34H44O19 
分子量:756.70 "    Forsythoside B    20mg/支    連翹酯苷B
1957/10/3    Palmitic acid    20mg/支    棕櫚酸
104112-82-5    Phellodendrine chloride    10mg/支    鹽酸黃柏堿
2141/9/5    Magnoflorine iodide    10mg/支    碘化木蘭花堿
136997-64-3    (-)-Syringaresnol-4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside    10mg/支    (-)-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷
110703-200726    含量測定    20mg    人參皂苷Rgl
人源細胞