利用SepaFlash®反相柱進行制備方法放大的探索

摘要

制備液相色譜技術作為一種能獲得高純度化合物的分離技術，近年來發展很快。與常規分析液相色譜相比，制備液相色譜的目的不是為了了解混合物中各個化合物的組成，而是通過色譜方法對混合物中各組分進行分離并分別收集，此時需要考慮的是收集組分的純度、回收率、操作時間、溶劑消耗等。制備液相色譜又分為高壓制備液相色譜和中低壓制備液相色譜，前者分離效率很高，所獲得樣品純度和回收率都較高，但同時也存在上樣量小、儀器復雜且昂貴等缺點；而后者因其固有的分離過程快速、上樣量大、儀器簡單成本低廉等優勢，目前在藥物合成、天然產物提取、精細化工等領域得到越來越廣泛的應用。

對于廣大小分子藥物合成人員而言，他們的研究工作中常常遇到這樣的一類樣品，即樣品具有很高的極性或親脂性，對于這類樣品的分離純化，一般不宜采用正相分離模式，原因在于樣品可能會與正相分離柱中的硅膠固定相產生很強的相互作用從而導致無法洗脫。而反相分離模式則可以很好的滿足此類樣品的分離純化要求，因而反相分離純化正在獲得越來越廣泛的應用。本文主要探索的是反相分離純化方法的放大，反相分離方法的建立通常基于分析型HPLC的分離結果，通過對分離條件進行調整，然后將方法轉移到4 g、12 g或者25 g反相快速分離柱（以下簡稱Flash柱）上進行小量樣品的分離，進一步優化分離方法，zui后將優化的方法放大至更大規格的Flash柱，從而達到分離純化大量樣品的目的。

實驗部分

本文基于常州三泰科技公司生產的SepaFlash®鍵合相系列Flash柱進行分離純化方法放大的探索，該系列產品的填料的基質為球形硅膠，硅膠表面鍵合相為C18，硅膠粒徑為20 - 45 μm,孔徑為100 Å，下表為該系列產品的具體規格參數。本實驗主要用到的產品規格為25 g、80 g及120 g。

表1. SepaFlash® Bond Series C18系列反相柱參數

（填料:High efficiency spherical C18, 20-45μm, 100Å）

1. 樣品

我們采用一組標準品混合物對分離純化方法放大實驗參數進行了初步探索，稱取組份A（0.1 g）、組份B（0.4 g）及組份C（7.5 g）溶于100 ml甲醇溶液中，充分混合均勻后待用，混合物樣品的化學結構式如圖1所示。

圖1. 混合物樣品各組分的化學結構式

2. 上樣量與Flash柱的選擇

分離純化方法放大主要是對待純化樣品的上樣量進行放大，更大的上樣量需要在更大規格的Flash柱上才能實現，一般來說反相Flash柱的上樣量是其填料量的0.5%-1%左右，對于某些易分離的樣品，其上樣量可以超過1%填料量這個限制，因此，在實際研究中還需要根據樣品性質對上樣量進行調整。

3. 實驗參數及結果討論

實驗過程中所用到的Flash柱規格分別為25 g和80 g，首先利用25 g Flash柱對1.2 ml混合物樣品進行了分離純化，實驗參數參見表2，所得分離圖譜如圖2所示。在上樣量為96 mg的情況下，相當于25g Flash填料量的0.4%，此時的分離圖譜顯示混合物樣品得到了基線分離，且從各組分的分離度來看0.4%的上樣比例還有較大的提升空間。根據這一實驗結果，我們僅對流速進行了調整，而洗脫梯度等條件保持不變，我們進一步地利用80 g Flash柱對4 ml混合物樣品進行了分離純化，所得分離圖譜如圖3所示。從圖3可以看出，保持與之前25 g規格Flash柱小試時同樣的上樣比例，可以獲得十分一致的分離圖譜，提示我們該放大方法對于此類樣品有著可以預期的分離效果。

表2. 標準品Flash分離純化實驗參數

圖2. 標準品混合物在25 g Flash柱上的分離圖譜

圖3. 標準品混合物在80 g Flash柱上的分離圖譜

因此，我們處理樣品量比較大的分離純化任務時，可以先選用一根小規格的Flash柱進行小量樣品的分離純化，優化分離方法；然后選擇一根大規格的同系列Flash柱進行上樣量放大后的分離純化，設置好相應的流速，將優化的分離方法導入，無需再次摸索分離方法，即可實現大量樣品的分離純化，從而大大節約寶貴的時間，降低溶劑消耗，提高工作效率。

4. 方法驗證

圖4. 某合成反應zui后一步，右側為目標產物

為了驗證反相Flash柱分離方法放大的實際效果，我們選擇了某合成反應的zui后一步產物作為樣品，通過上樣量的放大，檢驗放大方法的實際分離效果。待純化樣品為如圖4所示的合成反應產物，從結構式可知其極性很高，必須采用反相柱才能對其進行分離純化。此外，由于合成反應會生成不需要的副產物，因此需要將目標產物從副產物等雜質中分離純化出來，且目標產物的純度應大于95%。

取合成產物樣品1.25 g，溶解于10.0 ml甲醇中，充分混勻后待用。Flash分離純化實驗參數參見表3，具體分離方法見下表，所得分離圖譜如圖5及圖6所示。

表3. 合成產物Flash分離純化實驗參數

圖5. 合成產物在25 g Flash柱上的分離圖譜

圖6. 合成產物在120 g Flash柱上的分離圖譜

由圖5及圖6可知，在實際樣品的分離純化方法放大過程中，僅需設置好與不同規格Flash柱相適應的流速，無需對其他參數進行改動，即可獲得良好的分離效果，且兩個分離圖譜中目標物及其他雜質的保留時間及峰形等色譜參數保持一致，從而表明了放大方法的重現性及可靠性。經HPLC分析，Flash分離純化zui終獲得目標產物的純度>95%，可以滿足對目標產物純度的要求。

結論

在本應用案例中，合成產物的上樣量從162 mg放大至1.0 g，放大倍數為6倍，對應的Flash柱規格從25 g擴大至120 g，在此條件下對樣品的分離純化獲得了良好的分離度及重現性。這一結果表明：利用SepaFlash®反相Flash柱，配合SepaBeanTM machine，可以實現對高極性樣品分離純化方法的放大，且整個方法放大過程無需改變其他實驗參數，簡單便捷，為廣大實驗室科研人員在從事相關課題時提供了一種的解決方案。

關于SepaFlash® Bonded Series C18反相柱系列產品

常州三泰科技公司SepaFlash® Bond Series C18反相柱系列產品具有多種規格（參見表4）。

表4. SepaFlash® Bond Series C18系列反相柱參數

（填料:High efficiency spherical C18, 20-45μm, 100Å）

（本文作者為CBG應用技術研究中心：錢美圓，徐波。有任何疑問，都可以和我們一起探討）