PCR分子克隆實驗引物溶解稀釋方法熒光定量PCR儀

在實驗室進行分子克隆實驗時，經常需要合成大量的引物，而這些合成的引物首先要進行適當的稀釋才能使用。如果不稀釋就使用引物，往往造成引物的浪費和過早的活性喪失，更有一些被污染而不能使用。

因此，建議對合成的引物*行稀釋，然后使用。稀釋的引物利于保存和應用。

現將方法簡單敘述如下：

1. Oligo DNA是以OD260單位來計算的，這是指在1ml體積1cm光程標準比色皿中，260nm波長下吸光度為1A260的Oligo溶液定義為1 OD260單位，根據此定義，1 OD260單位相當于33μg的Oligo DNA，您可以根據此數據和您的Oligo DNA分子量，計算得到摩爾數以計算不同摩爾濃度的溶液。

2. 引物序列的分子量計算公式如下：

MW=（A堿基數×312）+（C堿基數×288）+（G堿基數×328）+（T堿基數×303）-61

例如：引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG   A=1  C=3  G=11  T=6

MW=（1×312）+（3×328）+（6×303）-61=6541

3. Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法計算：Oligo DNA中的每個脫氧核苷酸堿基的平均分子量近似為324.5，則一條Oligo DNA的分子量=堿基數×324.5。

例：

您得到一管標為5 OD260的20 mer Oligo DNA

分子量=20×324.5=6490

質量數=5×33=165μg

摩爾數=165/6490=0.025μmol=25nmol

若加滅菌雙蒸水400μl溶解，則濃度為25nmol/400μl=62.5μM

4. 裝有引物的eppendorf管一般保存于-20℃，臨用前稀釋。

5. 由于Oligo DNA呈很輕的干膜狀附在管壁上，打開時極易散失，所以打開管子前請先離心10,000rpm,1min,然后再慢慢打開管蓋。

6. 在裝有引物的eppendorf管內加入100-500μl雙蒸水，蓋上管蓋，充分上下振蕩5-10分鐘，再次離心10,000rpm,1min。

7. 計算原引物管primer的濃度（必要時測OD260核對廠家提供引物量是否正確）。

8. 計算并將應用primer稀釋為10pmol/μl。

9. 標明原引物管、應用引物管、稀釋方法，置-20℃保存。