反相液相色譜法測定嬰兒乳粉中*脂類含量

作者：顏景超1，湯水平2，彭燦 1,2，任國譜1,*

摘 要：目的：開發一種快速測定嬰兒配方乳粉中* 酯類含量的反相液相色譜法。方法：直接使用

二氯甲烷和甲醇體積比為2.5:1 的混合溶劑對樣品進行提取，在30℃的條件下采用等度洗脫，流動相采用體積比為

80:20 的甲醇- 三氯甲烷溶劑，流動相流速1.0mL/min；色譜柱溫度30℃，檢測波長325nm。結果：*醋

酸酯和* 棕櫚酸酯的回收率分別為100.1% 和102.8%，多次測定結果的相對偏差分別為1.18% 和0.96%，檢

出限分別為3.1ng 和4.3ng。結論：本方法操作簡單、精密度、回收率和靈敏度高，適用于嬰幼兒配方乳粉中的

* 酯類的檢測。

關鍵詞：* 酯類；嬰兒配方乳粉；反相液相色譜

Rapid Determination of Retinyl Esters in Infant FormulaMilkPowder by Reversed-Phase

High-performance Liquid Chromatography

YAN Jing-chao1，TANG Shui-ping2，PENG Can1,2，REN Guo-pu1,*

（1. College of Food Science and Engineering, CentralSouthUniversity of Forestry and Technology, Changsha 410004, China；

2. Hunan Avadairy Co. Ltd., Changsha 410200, China）

Abstract ：Objective: To develop a rapid reversed-phasehighperformance liquid chromatographic （RP-HPLC） method for

measuring retinyl esters in infant formula milk powder.Methods:Samples were directly extracted with a mixture ofdichloromethane

and methanol （2.5:1, V/V）. The chromatographic separationwasperformed at 30 ℃ in the isocratic elution mode using a

phase composed of a mixture of methanol and chloroform（80:20,V/V）. Results: Retinyl acetate and retinyl palmitatepresented

average spike recoveries of 6 replicates at 2 levels of100.1%ａnd 102.8%, with relative standard deviations of 1.18% ａnd0.96%,

respectively. The detection limits for retinyl acetateａndretinyl palmitate were 3.1 ng and 4.3 ng, respectively.Conclusion:The

method demonstrates simplicity and high precision, recoveryａndsensitivity, and thus has promising potential for practical

applications.

Key words：retinyl esters；infant formulamilkpowder；reversed-phase high performance liquid chromatography

中圖分類號：TS252.1 文獻標識碼：A 文章編號：1002-6630（2010）08-0154-04

VA 是一種重要的*，其主要生理功能

是維持視覺和骨骼健康、參與細胞分裂和細胞識別、參與生長、生殖及維持免疫系統的完整性等[1]。GB10766—1997《嬰兒配方乳粉Ⅱ、Ⅲ》和GB 10765 — 1997

《嬰兒配方乳粉Ⅰ》中規定嬰兒配方乳粉中VA 的含量

為1250～2500IU/100g，其允許添加使用的種類中包括* 醋酸酯和* 棕櫚酸酯[2]。目前測定嬰兒配

方乳粉中的VA多采用液相色譜法[3-9]，分析之前一般需對樣品進行皂化處理[3-7]，其過程溶劑消耗量大、操作繁瑣且不能測出*酯類的含量。本實驗采用反相色譜法定嬰兒配方乳粉中*酯類，前處理不經皂化，直接使用二氯甲烷和甲醇混合劑沉淀蛋白并提取*酯類，能快速檢出* 醋酸酯和*棕櫚酸酯的含量，為生產過程中的維生素的控制和風

※分析檢測食品科學2010, Vol. 31, No. 08 155

險評估體系的建立提供理論依據和實踐指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

嬰兒配方乳粉1 段（0～6 月嬰兒食用） 市售。甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷（均為色譜純） 美國edia公司；NaCl（分析純）南京化學試劑有限公司；* 醋酸酯、* 棕櫚酸酯標準品 美國Sigma 公司。

Waters alliance 2695 液相色譜系統（配有1200型，安捷倫公司紫外檢測器，Empower控制軟件）；UV-1800 紫外- 分光光度計日本島津公司；BF2000 型氮吹儀；800B低速臺

式離心機 上海安亭科學儀器廠；TC-C18 柱（4.6mm ×25cm，5μm） 美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

* 醋酸酯和* 棕櫚酸酯標準貯備液：分別準確稱取10mg 的*醋酸酯或*棕櫚酸酯，用甲醇定容于100mL 容量瓶中，制備成質量濃度為100μg/mL 的標準貯備液。*醋酸酯和*棕櫚酸酯標準工作液：分別取1mL * 醋酸酯或*棕櫚酸酯標準貯備液于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，制備成質量濃度為2μg/mL 的標準工作液。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取0.25g 樣品于10mL 離心管中，加入1mL 溫水充分溶解，加入7mL體積比為2.5:1的二氯甲烷和甲醇混合溶劑對樣品進行提取，旋渦振蕩5min，靜止5min后，加入1mL 飽和NaCl溶液，反轉振蕩3次，2500r/min 離心5min。將二氯甲烷層在氮氣下吹干，用甲醇溶

解。通過0 . 2 2μm 的濾膜過濾，用棕色小瓶收集。

1.2.3 標準品的紫外光譜測定

將* 醋酸酯和* 棕櫚酸酯的標準貯備液和標準工作液在波長200～400nm 內掃描，波長間隔1 nm。

1.2.4 色譜條件的正交試驗設計

因素為流動相體積配比、柱溫、流動相流速。本試驗不考慮交互作用，采用L9（34）正交試驗進行分析，有一個空列，可以作為實驗誤差以衡量試驗的可靠性，因素水平見表1。

1.2.5 定量分析

采用外標法定量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及線性關系

分別配制質量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg/mL的標準溶液，進樣測定，得到相應的峰面積。以標樣質量濃度為橫坐標、以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線見圖1。

因素

水平A 流動相體積配比B 色譜柱柱C 流動相流（甲醇:三氯甲烷） 溫/℃ 速/（mL/min）

1 100:1 30 1.0

2 90:10 40 0.8

3 80:20 50 0.6

表1 正交試驗因素水平

Table 1 Factors and levels in orthogonal arraydesignforoptimizing instrumental parameters forHPLCanalysis結果表明，測得的標準曲線在標樣質量濃度1～5μg/mL范圍內線性關系良好，*醋酸酯和*棕櫚酸酯標準曲線的回歸方程分別為y ＝ 1 6 2 0 0 4 x －6012.6 和y=99332x －2628.1，相關系數R2分別為0.9992和0.9991。

2.2 *色譜條件的選擇

2.2.1 *檢測波長的選擇

從圖2 可以看出，*醋酸酯和*棕櫚酸酯在此波長范圍內均有兩個特征吸收峰，依次分別為263、326nm和260、324nm，其中兩種物質zui大吸收峰均在波長325nm左右，所以*測圖1 * 醋酸酯和* 棕櫚酸酯標準曲線

Fig.1 Standard curves of retinyl acetate and palmitate

900

800

700

600

500

400

300

200

100

0

y=162004x － 6012.6

R2=0.9992

峰面積/（mV·s）

標樣質量濃度/（μg/mL）

0 1 2 3 4 5 6

y=99332x － 2628.1

R2=0.9991

* 醋酸酯* 棕櫚酸酯

圖2 * 醋酸酯和* 棕櫚酸酯的紫外吸收光譜

Fig.2 UV absorption spectra of retinyl acetate and retinyl

palmitate standards

2.0

1.5

1.0

0.5

0

260nm

吸光度

波長/nm

200 250 300 350 400

－ 0.2

263nm

2

2

1

326nm

324nm * 醋酸酯

*棕桐酸酯

1

影響嬰兒配方乳粉中* 酯類檢測的主要色譜156 2010, Vol. 31, No.08食品科學※分析檢測定波長為325nm。

2.2.2 色譜條件的影響

2.2.2.1 流動相配比的影響

實驗中發現，使用甲醇作為流動相，*棕櫚酸酯的保留時間都超過40min，不適合日常快速分析。采用甲醇與三氯甲烷不同的體積配比進行檢測，當甲醇與三氯甲烷的體積比為80:20時，*酯類的分離度較好，保留時間也較短，15min內完成分析。三氯甲烷過多流動性極性過小，保留時間過短不適合作為反相流動相，因此依據液相分析經驗在正交試驗中選擇甲醇與三氯甲烷的體積比范圍為100:1、90:10、80:20。

2.2.2.2 流動相流速的影響

當流動相流速減少時，色譜峰的分離效果稍好，但是*酯類的保留時間延長，而且峰寬有所增加，峰高降低，*酯類檢測的靈敏度降低。在液相測定過程中，流速一般設為1mL/min左右，流速過大會導致系統壓力過大；流速過小，導致保留時間過長，且峰變寬，靈敏度降低，因此在正交試驗中流動相流速水平選擇1.0、0.8、0.6mL/min。

2.2.2.3 色譜柱溫度的影響

通過30、40、50℃3個色譜柱溫度試驗，表明色譜柱溫度對樣品分離效果影響不大，只是對保留時間稍有影響；低溫30℃比高溫50℃時稍長，基本不影響峰高或峰面積，但是溫度高流動相容易產生氣泡。因此在正交試驗選擇色譜柱溫度的范圍為30～50℃。

2.2.3 色譜條件正交試驗結果

圖3 標準樣和樣品的色譜圖

Fig.3 HPLC chromatograms of mixed retinyl acetate ａndretinylplamitate standards and a sample （both at a mixing ratio of1:1）

試驗號

A 流動相體積配B 色譜柱空列C 流動相流

綜合得分

比（甲醇:三氯甲烷） 柱溫/℃ 速/（mL/min）

1 1（100:1） 1（50） 1 1（1） 67

2 1 2（40） 2 2（0.8） 65

3 1 3（30） 3 3（0.6） 61

4 2（90:10） 1 2 3 77

5 2 2 3 1 85

6 2 3 1 2 84

7 3（80:20） 1 3 2 92

8 3 2 1 3 87

9 3 3 2 1 95

k1 64.3 78.7 79.3 82.3 總分 713

k2 82 79 79 77

k3 91 80 77.7 75

R 26.7 1.3 1.6 7.3

表2 正交試驗結果

Table 2 Arrangement of experimental results of orthogonal array

design for optimizing instrumental parameters for HPLC analysis

采用L9（34）正交試驗，探討流動相體積配比、流動相流速、色譜柱溫度對*酯類測定的影響，從保留時間、峰型、系統壓力3個方面通過綜合評分來判斷方法優劣。滿分100 分，其中保留時間占50 分（3min計50分，53min 計0 分），峰型占40分（每種色譜條件基礎分25，峰不前伸加3 分，不拖尾加3 分，然后按峰型好壞一次加9 到1分），系統壓力10分（壓力1000～1500psi 計10 分，1500～2000psi 計6 分，超過2000psi計2 分）。結果見表2 。

使用極差分析法分析數據，結果表明，流動相配比對* 酯類測定的影響zui大，其影響順序是A 流動相體積配比＞ C 流動相流速＞B色譜柱溫度。結合標準溶液的紫外吸收光譜結果，確定*色譜條件為：流動相體積配比為80:20的甲醇-三氯甲烷溶液，色譜柱溫度30℃，流動相流速1.0mL/min，測定波長325nm。

根據以上確定的實驗參數對* 酯類標準品和

樣品進行分析，結果見圖3 。

由圖3 可以看出，* 酯類保留時間短，*醋酸酯大約為5min，*棕櫚酸酯大約為10min，色譜峰附近不存在干擾物質，和其他成分分離效果良好。樣品與標準峰形及出峰時間相吻合。

2.3 重復性實驗

0.032

0.024

0.016

0.008

0

4.793

AU

時間/min

0 3 6 9 12 15 9.893

a.標準樣（兩種標準液按1:1 混合后進樣）

0.0100

0.0075

0.0050

0.0025

0

4.668

AU

時間/min

0 3 6 9 12 15

9.893

b.樣品（兩種樣品zui終提取液按1:1 混合后進樣）

實驗號

* 醋酸酯 * 棕櫚酸酯

測定值/（IU/100g） 相對標準偏差/% 測定值/（IU/100g） 相對標準偏差/%

1 1942.43 1773.19

2 1937.19 1765.00

3 1987.82 1.18 1731.69 0.96

4 1963.38 1757.90

5 1931.95 1771.55

表3 重復性實驗結果（n=5）

Table 3 Repeatability test for the method（n=5）※分析檢測食品科學2010,Vol. 31, No. 08 157

按上述方法同一天內對市售嬰兒配方1段乳粉樣品進行5次重復測定，結果以*當量計。結果見表3。經統計分析表明，該法重復性好，*醋酸酯和*棕櫚酸酯的相對標準偏差分別為1.18% 和0.96%。

2.4 加標回收率實驗

在已知* 酯類含量的奶粉中加入標樣，樣品按上述方法處理后測定，結果以*當量計，結果

見表4 。

物質本底值/（IU/100g） 添加量/（IU/100g） 測定值/（IU/100g） 回收率/%平均回收率/%393299.5

2000 3794 96.0

*醋酸酯1952 3972 100.5 100.1

6012 101.0

4000 6190 104.0

5910 99.3

3835 102.0

2000 3733 99.3

*棕櫚酸酯1760 3812 101.4 102.8

6100 105.9

4000 5979 103.8

6002 104.2

表4 回收率實驗結果（n=6）

Table 4 Spike recovery test for the method （n=6）

選擇兩種添加水平，按上述方法進行測定。結果表明該法回收率高，6 次測定*醋酸酯和*棕櫚酸酯的平均回收率分別為100.1% 和102.8%。

2.5 zui低檢出限

按實驗選定的色譜條件，以3 倍信噪比（RSN）計算出* 醋酸酯和*棕櫚酸酯的zui低檢出限分別為3.1ng和4.3ng。

3 結 論

通過正交試驗確定了測定* 酯類的*色譜條件：流動相采用體積比為80:20的甲醇-三氯甲烷溶劑，流動相流速1.0mL/min，色譜柱溫度30℃，檢測波長325nm。加標回收率實驗結果表明：加標平均回收率為100.1%和102.8%（n=6）。重復性實驗結果表明相對偏差分別為1.18%和0.96%（n=5）。檢出限分別為3.1ng 和4 . 3 ng。本法樣品前處理簡單，測定準確性和精密度高，適用于嬰幼兒配方乳粉中* 酯類的定量分析，也適合于其他同類產品*酯類的測定。

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