His標(biāo)簽蛋白純化工具，率蛋白純化

 His標(biāo)簽蛋白純化工具

在大腸桿菌和別的原核系統(tǒng)中表達(dá)的多*標(biāo)簽重組蛋白一般運(yùn)用固定的金屬離子親和色譜來(lái)純化或稱為 IMAC. 在這個(gè)進(jìn)程中，支撐物 (一般是珠狀瓊脂糖凝膠或磁珠顆粒) 用適宜的耦合試劑來(lái)進(jìn)行衍生，比方氨三乙酸 nitrilotriacetic acid (NTA) 或亞氨乙酸 iminodiacetic acid (IDA). 這些螯合的基團(tuán)會(huì)固定所需求的二價(jià)金屬離子 (比方鎳，銅，鈷和鋅)，然后這些金屬離子zui后擔(dān)任和別離混合液蛋白中的目標(biāo)分子。在挑選運(yùn)用哪個(gè)配基上，你需要考慮 IMAC 樹脂的結(jié)合能力主要取決于被純化蛋白的性質(zhì)和在純化進(jìn)程中所運(yùn)用的金屬離子。

NTA，IDA，IMCA形式的His標(biāo)簽純化填料或者預(yù)裝柱產(chǎn)品，純化His標(biāo)簽融合蛋白

His-Tag親和層析填料

His-Tag可與多種金屬離子發(fā)生特殊的相互作用，如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，F(xiàn)e3+等，其原理是利用蛋白質(zhì)表面的特性，使之被吸附在凝膠柱上，從而達(dá)到分離純化蛋白的目的。

Ni2+在親和純化實(shí)驗(yàn)中的使用。根據(jù)結(jié)合基團(tuán)的不同，Ni2+親和層析柱可分為倆類——Ni-IDA和Ni-NTA。Ni2+有六個(gè)螯合價(jià)位，其中Ni-IDA螯合了三價(jià)，Ni-NTA螯合了四價(jià)。所以IDA的載量要比NTA的高，在同樣條件下Ni-IDA洗脫時(shí)的咪唑濃度也高于Ni-NTA。但其弱的結(jié)合力使金屬離子在洗脫階段時(shí)很容易浸出，與目的蛋白緊密結(jié)合，從而導(dǎo)致分離蛋白產(chǎn)量偏低，產(chǎn)品不純及金屬離子污染等問題。而NTA的顆粒粒度均勻，粒徑更小，并且螯合鎳更穩(wěn)定，能耐受較高的還原劑，使填料更加穩(wěn)定，鎳離子不易脫落。

His-tag作為蛋白純化時(shí)的標(biāo)簽，其優(yōu)勢(shì)在于：

1. N-端的His-Tag與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制兼容，有利于蛋白表達(dá)；

2. 采用IMAC（固定化金屬離子親合層析）純化His-Tag融合蛋白操作更加簡(jiǎn)便；

3. His-Tag對(duì)目的蛋白本身特性幾乎沒有影響，不會(huì)改變目的蛋白本身的可溶性和生物學(xué)功能；

4. His-Tag非常小，在融合蛋白結(jié)晶后對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)沒有影響；His-Tag的免疫原性相對(duì)較低，可將純化的蛋白直接注射入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行免疫并制備抗體；

與其它親和標(biāo)簽構(gòu)建成雙親和標(biāo)簽，并可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)；

His-Tag融合蛋白的適用范圍也較廣，既可以在非離子型表面活性劑存在的條件下純化，也可以在變性條件下進(jìn)行純化。前者通常用來(lái)純化疏水性強(qiáng)的目的蛋白，而后者則通常純化包涵體蛋白。

IMAC在通常的情況下是比較穩(wěn)定的，但螯合劑的存在則會(huì)導(dǎo)致其金屬離子脫落。例如在E.coli的裂解液中普遍存在一些非特異的弱螯合劑，如在三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生了二羧酸類物質(zhì)。因此，E.coli在某些高壓情況下就會(huì)產(chǎn)生高特異性的金屬螯合劑（通常存在于細(xì)菌的細(xì)胞周質(zhì)中），導(dǎo)致His-Tag融合蛋白純化的純度和產(chǎn)量大大降低。所以在進(jìn)行純化His-Tag融合蛋白的實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需要去除螯合劑。

PurKine™ His-Tag 純化系統(tǒng)基于創(chuàng)新的高載量IMAC基質(zhì)，確保一步操作即可從總裂解液中純化出His-Tag蛋白。 我們的金屬離子螯合方案使其可兼容：還原劑（如 DTT）、螯合金屬蛋白酶抑制劑（如EDTA）和大部分緩沖液底物和鹽環(huán)境。 PurKine產(chǎn)品線具有多種形式如：自由組合：螯合基團(tuán) (IDA，NTA or Super NTA)，交聯(lián)介質(zhì) (4% 或 6% 交聯(lián)的瓊脂糖凝膠，磁珠）,和金屬離子 (Ni，Co,Cu,無(wú)金屬IMAC) ，的的組裝螯合配方，保證了His標(biāo)簽蛋白質(zhì)的zui大產(chǎn)量，穩(wěn)定性以及可溶性。

Fig. 1. His標(biāo)簽重組蛋白純 化結(jié)果。PurKine™ His-Tag Ni-NTA Resin 4FF (Lane B)

；其它品牌的對(duì)應(yīng)的純化產(chǎn)品 (Lane C) 

PurKine™ His-Tag的純化填料也可以以預(yù)裝柱和試劑盒的形式提供，使用更加便捷。此外，還有瓊脂糖凝膠樹脂填料和磁珠形式。

PurKine™ His-Tag Ni-Super Resin 是 Ni-NTA Resin 的替代品，比起NTA，Ni-Super 與 Ni 有更緊致結(jié)合構(gòu)象，螯合更加穩(wěn)定，能更高限度的兼容各類化學(xué)物質(zhì)，比如還原劑、螯合劑。PurKine? His-Tag Ni-Super Resin特別適用于含有 會(huì)引起Ni離子脫落介質(zhì)的樣品中的His-Tag蛋白的純化，比如含有螯合劑的分泌蛋白樣品溶液。此外，它還具有高流速的特 性，適合用于蛋白質(zhì)的大規(guī)模純化。

Fig.2. PurKine? His-Tag Ni-Super Resin能夠兼容多種的化學(xué)物 質(zhì)：0.01M HCl (Lane C) ，0.01M NaCl (Lane D)

Fig.3. PurKine? His-Tag Ni-Super Resin能夠兼容多種的化學(xué)物 質(zhì)： 6M Gua-HCl (Lane D)，1M NaCl (Lane E)

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