常見的ELISA原理與分類

                                                                           ELISA原理與分類

一、ELISA的原理

ELISA的根底是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶符號。在固相載體外表的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶符號的抗原或抗體既保存其免疫學活性，又保存酶的活性。在測守時，受檢標本（測定其間的抗體或抗原）與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用洗刷的辦法使固相載體上構成的抗原抗體復合物與液體中的別的物質分隔。再參加酶符號的抗原或抗體，也經過反響而在固相載體上。此刻固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈必定的份額。參加酶反響的底物后，底物被酶催化變成有色產品，產品的量與標本中受檢物質的量直接有關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。因為酶的催化功率很高，直接地擴大了免疫反響的成果，使測定辦法到達很高的敏感度。

二、ELISA的類型

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定辦法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶符號的抗原或抗體，稱為"物"（conjugate）；（3）酶反響的底物。根據試劑的來歷和標本的狀況以及檢查的具體條件，可規劃出各種不一樣類型的檢查辦法。用于臨床查驗的ELISA首要有以下幾種類型：

1.雙抗體夾心法測抗原

雙抗體夾心法是檢查抗原zui常用的辦法，操作進程如下：

1）將特異性抗體與固相載體聯合，構成固相抗體。洗刷除掉未的抗體及雜質。

2）加受檢標本，保溫反響。標本中的抗原與固相抗體，構成固相抗原抗體復合物。洗刷除掉別的未物質。

3）加酶標抗體，保溫反響。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體。*洗刷未的酶標抗體。此刻固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量有關。

4）加底物顯色。固相上的酶催化底物變成有色產品。經過比色，測知標本中抗原的量。

2.雙抗原夾心法測抗體

反響形式與雙抗體夾心法相似。用特異性抗原進行包被和制備酶物，以檢查相應的抗體。與直接法測抗體的不一樣之處為以酶標抗原替代酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因而其敏感度相對高于直接法。乙肝標志物中抗HBs的檢查常選用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原構造的不一樣，尋覓合適的符號辦法。

3.直接法測抗體

直接法是檢查抗體常用的辦法。其原理為使用酶符號的抗抗體（抗*抗體）以檢查與固相抗原的受檢抗體，故稱為直接法，操作進程如下：

1）將特異性抗原與固相載體聯合，構成固相抗原。洗刷除掉未的抗原及雜質。

2）加稀釋的受檢血清，保溫反響。血清中的特異抗體與固相抗原，構成固相抗原抗體復合物。經洗刷后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的別的成份在洗刷進程中被洗去。

3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢查總抗體，但通常多用酶標抗人IgG檢查IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體，然后直接地符號上酶。洗刷后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正有關。

4）加底物顯色本法首要用于對病原體抗體的檢查而進行流行癥的確診。

直接法的長處是只需改換包被抗原就可使用同一酶標抗抗體樹立檢查相應抗體的辦法。直接法成功的關鍵在于抗原的純度。盡管有時用粗提抗原包被也能獲得實踐有用的成果，但應盡可能予以純化，以進步實驗的特異性。特別應注意除掉能與通常健康人血清發作反響的雜質，例如以 E.Coli為工程酶的重組抗原，如其間富含E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發作反響。抗原中也不能富含與酶標抗人Ig反響的物質，例如來自人血漿或人體安排的抗原，如不將其間的Ig去掉，實驗中也發作假陽性反響。別的如抗原中富含無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被作用。直接法中另一種攪擾要素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。患者血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的外表。因而在直接法中，抗原包被后通常用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以關閉（blocking）固相上的空閑空隙。別的，在檢查進程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以防止過高的陰性本底影響成果的判別。

4.競賽法測抗體

當抗原材猜中的攪擾物質不易除掉，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢查特異性抗體。其原理為標本中的抗體和必定量的酶標抗體競賽與固相抗原。標本中抗體量越多，在固相上的酶標抗體愈少，因而陽性反響呈色淺于陰性反響。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有攪擾物質，直接包被不易成功，可選用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后參加抗原，構成固相抗原。洗刷除掉抗原中的雜質，然后再加標本和酶標抗體進行競賽反響。競賽法測抗體有多種形式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競賽，抗HBc ELISA通常選用此法。另一種形式為將標本與抗原一起參加到固相抗體中進行競賽，洗刷后再參加酶標抗體，與在固相上的抗原反響。抗HBe的檢查通常選用此法。

5.競賽法測抗原

小分子抗原或半抗原因缺少可作夾心法的兩個以上的位點，因而不能用雙抗體夾心法進行測定，能夠選用競賽法形式。其原理是標本中的抗原和必定量的酶標抗原競賽與固相抗體。標本中抗原量含量愈多，在固相上的酶標抗原愈少，zui終的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。