南京信帆生物：Sigma去糖基化試劑盒之使用心得

Sigma-Aldrich的天然蛋白去糖基化試劑盒（Native Protein Deglycosylation Kit，貨號NDEGLY）可在天然條件下去除糖蛋白上的N連接寡糖。糖基化蛋白修飾通常位于折疊蛋白中不容易接近的位置，因此在未變性的情況下，不大可能通過標準的肽N- 糖苷酶 F（PNGase F）處理來去除。如果您的下游分析需要折疊蛋白（如酶學分析或蛋白相互作用分析），那么這個試劑盒也許適合您。

此試劑盒包含了內糖苷酶F1、F2和F3，以及相應的反應緩沖液。與PNGase F相比，這些內糖苷酶對蛋白構象沒那么敏感，更適合在蛋白未變性的情況下去除各種N連接寡糖。這三種內糖苷酶有著不同的連接特異性。F1能夠去除低聚甘露糖和混合寡糖結構，而F2和F3則分別能去除兩個分支和三個分支的結構。

此試劑盒在去糖基化上的效果如何呢？美國西北大學的博士生A. Caulfield介紹了他的使用心得。

據Caulfield介紹，他們想要確定目的蛋白在去糖基化之后的生物學活性。糖基化的去除可通過Western blot來評估，即蛋白條帶的分子量減少。他們的目的蛋白包含N連接糖基化。此蛋白在HEK 293細胞中產生，并利用其N端的FLAG標簽來純化。之前他們試過PNGase，但無法讓目的蛋白去糖基化。

在這一實驗中，他們將2 ug目的蛋白與0.02個單位的內糖苷酶F1、F2或F3及其相應的緩沖液混合，在37°C孵育4小時。之后通過標準的SDS-PAGE和Western blot來評估去糖基化的程度。

正如他們預計的那樣，蛋白被去糖基化，且各個樣品之間的結果相當一致。有趣的是，內糖苷酶F1對他們的蛋白起作用，而F2和F3則*沒效果。Caulfield認為，了解哪種酶能使蛋白去糖基化，將帶來一些有關寡糖鏈性質的信息。

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