南京信帆生物：免疫組化常見問題之無染色和弱陽性原因分析

當免疫組化染色沒有出現預期結果時，應系統地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。

對照/標本無染色
① 確認是否忽略了應該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 確認所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。
③ 對照抗體的標簽確認是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。
⑤ 檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標記了酶或熒光素的抗體，現在大多數試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應避免反復凍融，試劑保存時一定要避免與揮發性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。
⑥ 檢查標本的儲存條件，用已知陽性的標本來同時做陽性對照。
⑦ 檢查色原/底物溶液，zui簡單的檢測方法是將一滴標記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發生預期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應在一定時間內用完，否則會失效。
⑧ 檢查沖洗液是否和反應試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。
⑨ 檢查復染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。

弱陽性
如果陰性對照沒有染色而陽性對照標本弱陽性，除了考慮上述因素外，還應考慮：
① 標本的固定方式，不當的固定方式或固定時溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數量和質量。
② 不適當的抗原修復方式，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應參照生產廠家的說明，同時結合標本的具體情況而定。
③ 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑生產廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出的使用濃度。
④ 切片上了過多的沖洗液，當抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。
⑤ 孵育時切片是否放置水平，否則會導致抗體流失。
如果陰性對照沒有反應，陽性對照反應良好，而標本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。

當免疫組化染色沒有出現預期結果時，應系統地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。

對照/標本無染色
① 確認是否忽略了應該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 確認所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。
③ 對照抗體的標簽確認是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。
⑤ 檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標記了酶或熒光素的抗體，現在大多數試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應避免反復凍融，試劑保存時一定要避免與揮發性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。
⑥ 檢查標本的儲存條件，用已知陽性的標本來同時做陽性對照。
⑦ 檢查色原/底物溶液，zui簡單的檢測方法是將一滴標記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發生預期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應在一定時間內用完，否則會失效。
⑧ 檢查沖洗液是否和反應試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應含有疊氮鈉。
⑨ 檢查復染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。

弱陽性
如果陰性對照沒有染色而陽性對照標本弱陽性，除了考慮上述因素外，還應考慮：
① 標本的固定方式，不當的固定方式或固定時溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數量和質量。
② 不適當的抗原修復方式，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應參照生產廠家的說明，同時結合標本的具體情況而定。
③ 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑生產廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出的使用濃度。
④ 切片上了過多的沖洗液，當抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。
⑤ 孵育時切片是否放置水平，否則會導致抗體流失。
如果陰性對照沒有反應，陽性對照反應良好，而標本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。

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