南京信帆生物：提高RT-PCR的靈敏度與產物長度

逆轉錄（RT）以及隨后進行的PCR（RT－PCR）是RNA 分析中使用得zui廣泛的技術之一。如果需要平行分析多個RNA 樣品，方法為一步法RT－PCR。如果要擴增困難目標片段或從單一cDNA 池中擴增多重目標片段則會選擇兩步法。Eppendorf 推出的全新的cMaster RTplusPCR 系統適用于各種RT－PCR 應用。它含有一種全新的重組逆轉錄酶和一種具有高保真性的PCR 酶混合物。另外，RTplusPCR反應緩沖液能夠自動調節鎂離子濃度，因此這一重要成分的濃度無需優化。這種自我調節的效果是通過對鎂離子的弱螯合作用來實現的。如果鎂離子濃度過高，螯合劑會與過剩的鎂離子結合，如果反應（Taq 或DNA）需要鎂離子，鎂離子就會被釋放出來。這種創新技術提高了cMaster RTplusPCR的靈敏度和特異性。使cMaster RTplusPCR試劑盒既能進行一步法，又能進行兩步法RT－PCR，而且具有很大的動力學檢測范圍，能擴增得到的PCR產物長度范圍也很大（一步法反應zui長可擴增5.3 kb片段；兩步法方案zui長能擴增12.3 kb 片段）。

下面的實驗可以展示該試劑盒在不同應用中的表現。
實驗1關注新試劑盒在一步法RT－PCR 中的靈敏度。而在一步法應用中，zui重要的因素就是能夠采用盡可能少的目標材料進行有效工作。

實驗2顯示應用一步法方案進行長距離RT－PCR 不再是個難題。試劑盒中創新的緩沖液能同時保證逆轉錄酶和高保真酶混合物都具有延伸性。

本系統提供的兩步法RT－PCR 備選程序適用的模板范圍很廣。實驗3描述了對不同模板的擴增情況。這個新的系統能為所有的RT目標提供全面解決方案，不論需要擴增的片段是中等長度還是極長，不同來源的總RNA 中轉錄本是低豐度還是高豐度。

材料和方法

Eppendorf cMaster RTplusPCR系統
Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic試劑盒
所有的PCR反應均在Eppendorf Mastercycler® gradient梯度PCR儀上進行。

實驗1：一步法靈敏度檢測RT－PCR 
擴增目標：500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。
模板RNA：從人HELA細胞中純化的總RNA。反應中應用的模板濃度從1μg遞減至10pg。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系統，標準一步法RT－PCR方案。1:10 稀釋RTplusPCR 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mM，反應總體積50μl
循環參數：

cMaster RTplusPCR 系統顯示出一種依賴于模板RNA 量的寬廣的產物產量動力學范圍。能從低至10 pg 的HELA 總RNA中檢測到α微管蛋白mRNA。

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