南京信帆生物：酵母雙雜交實驗項目操作及心得體會

1.構建CaM誘餌質粒

① PCR 擴增CaM基因的開放閱讀框，正向和反向引物分別加接酶切位點。

② 擴增得到的CaM插入t載體( T–CaM) 。

③ T–CaM和pGBKT7 質粒分別雙酶切。

④ 膠回收目的DNA。

⑤ 將CaM連入pGBKT7，構建成表達載體pGBKT-CaM，轉化大腸桿菌DH5α。

⑥ 因pGBKT7含Kan+抗性基因，在Kan+抗性平板上篩選陽性克隆。

⑦ 測序驗證CaM與gal4 DNA 結合功能區融合，插入序列讀框正確、無堿基突變。

2.pGBKT7 – CaM轉化酵母菌Y2HGold

將pGBKT7- CaM采用PEG/LiAc法轉化酵母菌Y2HGold，涂布于SD – Trp固體培養基上，30° C 3-5天，菌落長出。

進行CaM自激活鑒定及毒性測定。

3.龍須菜高溫脅迫表達cDNA文庫構建

① 設定溫度梯度(26-35°C)和時間梯度(12-72 h)，對龍須菜進行高溫脅迫。

② 提取龍須菜總RNA(RNA提取按照Qiagen試劑盒說明書進行，RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen)。

③ 應用SMART技術構建龍須菜高溫脅迫表達cDNA文庫，3’和5’引物分別加接酶切位點。

4.文庫篩選載體構建

將龍須菜高溫脅迫表達文庫cDNA雙酶切，連入同樣雙酶切的AD 克隆質粒pGADT7中，用PEG/LiAc 轉化法將cDNA 文庫質粒轉化到酵母菌Y187中，SD – Leu平板上30 ℃培養3～5 天，菌落長出。

5.酵母交配轉化及陽性克隆的篩選

將酵母菌Y187/ pGADT7-cDNA與酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM進行酵母交配轉化(Yeast Mating)，SD–Trp/-Leu/Aba/X-α-gal平板上30 ℃培養3～5 天，篩選藍色菌落，再將陽性克隆在SD–Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-α-gal平板上進行驗證。

6.陽性克隆質粒的提取和保存

提取陽性克隆酵母菌的質粒，轉化至大腸桿菌E.coli DH5α中，因pGADT7質粒含Amp+ 抗性基因，在Amp+抗性平板上篩選陽性克隆AD- X(X代表陽性克隆中攜帶的龍須菜cDNA，即為初步篩選得到的相互作用蛋白質的cDNA)。

7.陽性克隆的再驗證

pGBKT7 –CaM 與AD–X質粒共轉化酵母菌Y2HGold，重新驗證相互作用消除假陽性。按表1組合，轉化后的酵母菌涂布于SD–Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-α-gal平板上，30 ℃培養5～7 天，篩選藍色克隆而且無自激活性的蛋白即為相互作用的蛋白。

表1 　陽性克隆再驗證的質粒組合方案

8.對相互作用蛋白X進行測序和序列分析

以pGADT7載體引物對AD–X進行測序，測序結果與NCBI GenBank數據庫進行BLAST分析和序列結構分析。

心得經驗：

酵母雙雜交系統對于研究蛋白與蛋白之間的相互作用雖然具有篩選量大、效率高及應用廣泛等優點，但有它自身的缺陷。酵母培養的周期與大腸桿菌相比較長，酵母轉化的過程較繁復，耗時較長，而且存在假陽性較多的問題，陽性克隆工作量太大，驗證工作繁重。在此項目中酵母雙雜交實驗zui關鍵的步驟是酵母培養時間的掌控。在吸取5uL轉入含50mL YPDA液體培養基的250mL錐形瓶中，30℃120rpm/min振蕩培養的步驟中其OD600達到0.15-0.3(16-20h)很重要，這關系到酵母細胞的濃度及生長狀態。且下一步把沉淀下來的酵母細胞轉入含100mLYPDA液體培養基的250mL錐形瓶中，30℃120rpm/min振蕩培養達到其OD600達到0.4-0.5(3-5h)同樣重要。在這3-5h培養的原因是讓細胞至少完成兩次分裂，而且在細胞3-4次分裂間，轉化效率恒定。在酵母交配實驗中，30 ℃、80r/min恒溫振蕩培養時間20-24h也甚為重要，培養時間應由在顯微鏡下是否能看到米奇頭形狀的雜交細胞為準，如果沒有觀察到雜交細胞，應適當延長培養時間，而如果觀察到，應停止振蕩培養，防止雜交細胞增殖，增加篩選工作量。培養酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM(SD/-Trp)時，出現了酵母菌種從第四天開始出現變紅的情況，查找資料得知是由于酵母菌在缺乏腺嘌呤的生長環境中，產生紅色代謝物的導致的。因而應盡量縮短此步的培養時間。本項目用變紅的菌進行下一步的步驟，實驗結果并沒有受影響，且變紅的菌在腺嘌呤豐富的YPDA液體培養基中培養時，后代菌種恢復白色。綜上，酵母培養時間的控制是酵母雙雜交實驗成功的關鍵。

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