液相色譜法測定茶葉中黃曲霉毒素B1

1.適用范圍
本方法適用于出口茶葉中黃曲霉毒素B1含量的檢驗。

2.原理概要
樣品用三氯甲烷提取，提取液經(jīng)硅膠柱凈化，凈化后的提取液用三氟乙酸衍生，用配有熒光檢測器的液相色譜儀測定，外標法定量。

3.主要試劑和儀器
3.1.主要試劑
三氯甲烷；
正己烷；
苯；
甲醇：紫外光譜級；
乙腈：紫外光譜級；
三氟乙酸；
乙腈-水溶液（1＋1）；
三氯甲烷-甲醇溶液（95＋5）；
苯-乙腈溶液（98＋2）；
黃曲霉毒素B1標準品：純度≥99%；
黃曲霉毒素B1標準溶液：準確稱取適量的黃曲霉毒素B1標準品，以苯-乙腈溶液于棕色容量瓶中，配成濃度為10μg/mL標準貯備液。根據(jù)需要，再配成適當濃度的標準工作溶液。
3.2.儀器
液相色譜儀，配有熒光檢測器；
硅膠小柱：Waters Sep-pak Silica前處理小柱或相當?shù)墓枘z前處理小柱；
振蕩器；
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，配有100mL具尾管的圓底燒瓶；
微量注射器；
離心管：5mL具塞磨口；
粉碎機；
濾膜：有機系用，0.45μm；
微孔濾膜過濾器：有機系用，0.5μm。

4.試樣的抽取與制備
4.1.檢驗批
以不超過2000件為一檢驗批。
同一檢驗批的商品應具有相同的特征，如包裝、標記、產(chǎn)地、規(guī)格、等級等。
4.2.抽樣數(shù)量
批量，件 Z低抽樣數(shù)，件
1～5 1
6～50 2
51～500 11
501～1000 16
1001～1500 19
1501～2000 20

4.3.抽樣方法
從整批產(chǎn)品堆垛的上下不同部位隨機抽取2.2規(guī)定的件數(shù)，逐件開啟。分別倒出全部茶葉于塑料布上，用取樣鏟從每件中各取出有代表性的樣品約500g。將所取樣品充分混勻，用四分法或分樣器逐步縮分出500g，裝入潔凈密封的樣品筒內(nèi)，加封后，標明標記，及時送實驗室。
4.4.試樣制備
將所取回樣品全部磨碎，通過20目篩，混勻，均分成兩份試樣，裝入潔凈容器內(nèi)，密封，標明標記。
4.5.試樣保存
將試樣于室溫下保存。
注：在抽樣和制樣的操作過程中，必須防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。

5.過程簡述
5.1.提取
稱取試樣5.0g（到0.1g）置于100mL具塞錐形燒瓶中，加入15mL三氯甲烷，于振蕩器上提取30min，然后經(jīng)墊有玻璃纖維的漏斗過濾。收集濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的具尾管圓底燒瓶內(nèi)，并用三氯甲烷洗滌濾渣，收集濾液至約20mL。
5.2.凈化
用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上述濾液在50℃水浴中濃縮至約1mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，注入硅膠小柱中。用2～4mL正己烷洗滌燒瓶后淋洗小柱，棄去流出液。然后用3～4mL三氯甲烷-甲醇溶液以每秒鐘2滴的流速洗脫，收集洗脫液于離心管中。用氮氣緩緩吹干，供衍生用。
5.3.衍生
5.3.1.試樣
加200μL正己烷和50μL三氟乙酸于上述離心管中，蓋緊磨口塞，超聲振蕩1min，靜置10min，打開磨口塞，緩緩通入氮氣至干。用乙腈-水溶液（1＋1）定容至1.0mL，超聲1min，用0.5μm濾膜過濾，濾液供液相色譜用。
5.3.2.標準工作溶液
取1.0mL標準工作溶液，用氮氣緩緩吹干，按5.3.1步驟操作。
5.4.測定
5.4.1.色譜條件
色譜柱：NOVA PAKc18，300mm×3.9mm（內(nèi)徑）；
流動相：甲醇-水溶液（42＋58）；
流速：0.8mL/min；
熒光檢測器：激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長425 nm；
色譜柱溫度：室溫。
5.4.2.測定
根據(jù)樣液中黃曲霉毒素B1的含量情況，選定峰高相近的標準工作溶液。標準工作溶液和樣液中黃曲霉毒素B1衍生物的響應值均應在儀器檢測線性范圍內(nèi)。對標準工作溶液和樣液的衍生物溶液等體積參插進樣測定。在上述色譜條件下，黃曲霉毒素B1衍生物保留時間約為8min。
5.4.3.空白試驗
除不加試樣外，按上述測定步驟進行。

6.結(jié)果計算
用色譜數(shù)據(jù)處理機或按下式計算試樣中黃曲霉毒素B1的含量：
X＝ A·cs
As·c

式中：X —— 試樣中黃曲霉毒素B1的含量，mg/kg；
A —— 樣液中黃曲霉毒素B1衍生物的峰面積，mm2；
cs —— 標準工作溶液中黃曲霉毒素B1的濃度，μg/mL；
As —— 標準工作溶液中黃曲霉毒素B1衍生物的峰面積，mm2；
c —— Z終樣液所代表試樣的濃度，g/mL。
注：計算結(jié)果需扣除空白值。

7.低限和回收率測定
7.1.低限
本方法的測定低限為0.001mg/kg。
7.2.回收率
回收率的實驗數(shù)據(jù)：黃曲霉毒素B1的添加濃度在0.001～0.5mg/kg范圍內(nèi)，回收率為89.1%～104.9%。