液相色譜法分析中藥及植物藥的進展(1)

　植物藥越來越受到人們的重視。據報道，*大約有70%的人口醫療依靠各種類型的植物藥〔1，2〕。對植物藥的興趣主要基于以下兩個原因，一是人們普遍認為植物藥具有較小的毒性，二是用合成方法尋求新藥物的可能性變得越來越小，同時已有的西藥對一些疑難病癥無能為力。隨著對植物藥需求的不斷增長，開展植物藥的藥代動力學、毒理學研究和質量控制，開發快速、靈敏、具有選擇性的分析方法也越來越迫切。過去20年的實踐經驗表明，液相色譜（HPLC）是一種非常有效和普遍適用的植物藥分析方法。近來，由于各種分析柱、高選擇性和高靈敏度的檢測器和復雜的商品化儀器聯用系統的出現，植物藥分析領域已被大大地推進。本文就HPLC在中藥及植物藥研究中應用的進展做簡要評述。

2　色譜技術方面的進展

2.1　固定相

　在過去的幾年里，出現許多適于堿性物質分離的商品色譜柱, 其填料具有更好的重現性、更高的耐酸堿穩定性以及不易受次級保留影響。此外，使用新的固定相載體和將各種配體鍵合到常用的載體上，從而提高了反相色譜、離子色譜、離子交換色譜填料的選擇性。與此同時，新的手性固定相不斷出現，應用范圍不再局限于個別的化合物〔3〕。
　　
    Theodoridis比較了專門為堿性化合物的HPLC分析設計的新柱添料，其中包括有硅膠基體的C18-羥基、硅膠基體的C18和C8、硅膠基體的甲基苯基-丙基甲硅烷基、以氧化鋁和聚苯乙烯-二乙烯基苯為基體的聚丁二烯填料。在每個被檢驗柱子上進行了流動相優化，并研究了流動相pH、有機改性劑性質、含量和鹽濃度對保留選擇性和分離度的影響。實驗表明，當基于分析物間pKa值的差異進行分離時，洗脫液的pH值是影響分離的一個重要因素。堿性化合物在這樣的C18柱和聚合物柱上能得到滿意的分離結果，這些新柱填料已被用于金雞納生物堿和長春花生物堿的分析〔4，5〕。
　
　*，光學異構體有不同的藥理活性。Kusu等〔6〕用一手性配位體交換柱，以1 mmol/L醋酸銅和20 mmol/L醋酸銨（pH=6.4）的混合水溶液為流動相直接拆分了柑橘屬植物、中藥材、中藥中的脫氧腎上腺素光學異構體，在0.2～100 μmol/L濃度范圍內有很好的線性(r=0.999)，檢測限可達0.2 μmol/L (S/N=3)。
　　一系列具有兩個或三個活性中心的四環、五環長春花生物堿的立體異構體能夠在手性α1-酸糖蛋白（AGP）和人血清白蛋白（HAS）柱上得到分離〔7〕。以磷酸鹽緩沖溶液（pH 5～7）/乙腈（ACN）或異丙醇為流動相，比較兩種柱上得到的譜圖，發現這類化合物與AGP固定相有更大的親合力。在應用范圍和立體選擇性方面，AGP柱都優于HAS柱。

2.2　檢測
　
　紫外檢測仍是zui普遍的檢測方法，與此同時其它檢測方法顯示出了不可替代的*性。

2.2.1　電化學檢測器

　Kusu和其合作者〔8〕在分析枳實和枳殼中的脫氧腎上腺素，N-甲基酪胺時發現電化學檢測器不僅有特殊的選擇性，而且具有很高的靈敏度，而以往用紫外檢測需要復雜的樣品預處理才能避免樣品中其它組分的干擾。在Kaseisorb LC-ODS-120-5色譜柱上，以0.02 mol/L檸檬酸-0.02 mol/L NaH2PO4（7：3 V/V，pH=3）為流動相，檢測電位1.2 V(vs. Ag/AgCl)，*為內標，脫氧腎上腺素、N-甲基酪胺的檢測限分別為1.3 μg/L和1.2 μg/L。青蒿素及其類似物既無強紫外吸收也無熒光發色團，且沒有合適的衍生反應，因此很難對它們及其代謝產物進行HPLC分析，Chan〔9〕用HPLC-電化學檢測器（ECD）測定了血漿中的青蒿素。

2.2.2　光電二極管陣列檢測器
 
    光電二極管陣列檢測器已被普遍用于鑒別液相色譜的峰純度和提高重疊峰的定量準確度〔10，49，63，64〕。美登（maytus）中的美登類化合物（maytansinoids）是一類很強的抗癌藥物，這類物質具有很相似的結構，分子間的差異很小，給分析帶來困難。Reich等人〔11〕利用Varian 9065二極管陣列檢測器為這類物質建立了一個光譜數據庫，即使在分析物沒有得到基線分離的情況下，這一譜庫也能大大簡化在復雜植物萃取物的未知基質中識別已知化合物。在此基礎上，分別在硅膠、雙醇基、氨基和氰基柱上對這類物質進行了系統研究，基于分子大小和與固定相的相互作用提出了此類物質復雜的保留機理。

2.2.3　蒸發光散射檢測器（ELSD）

　ELSD是一種質量型檢測器，流動相被氣流霧化后進入加熱管，在管內溶劑被揮發，一束狹窄光通過分析物粒子后發生散射，散射光由光電倍增管收集，它的響應取決于被分析物粒子的大小和數目。由于ELSD只對不揮發的物質響應，其特點是，即使在梯度洗脫的情況下也能得到比較平穩的基線。現在這一檢測器已被成功地用于不揮發物質的分析，如：糖類、脂類、活性劑等。人參是常用的強身滋補品，有抗疲勞、鎮靜、抗胃潰瘍等效用。許多研究表明，這些藥效源于活性組分人參皂甙。由于人參皂甙缺少發色團，用紫外檢測器檢測這類物質時，只能在短波區。在短波區內檢測，用梯度洗脫同時分離多個人參皂甙時，基線漂移嚴重，影響分析的準確度。Park等〔12〕用HPLC-ELSD同時分離和測定了人參皂甙Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3 和Rh1等。ELSD的管溫設置在145℃，N2流量40 mm(轉子流量計單位)，檢測限在35～155 ng之間。此方法的靈敏度和選擇性都優于HPLC-UV，在一次洗脫中完成主要人參皂甙的定量分析。

2.2.4　質譜

　近來，液相色譜-質譜（LC-MS）聯用，尤其是液相色譜-質譜-質譜（LC-MS-MS），已成為發展zui快的分析技術之一。樣品引入由zui早的傳送帶到目前液體樣品的直接引入，離子化技術由熱噴霧（TSP）、連續流快原子轟擊（CF-FAB）、粒子束接口（PB），發展到現在的大氣壓化學電離（APCI）和電噴霧離子化（ESI）。 PB 的缺點是對難揮發性物質的靈敏度低，因此不適于天然產物中極性物質的分析；熱噴霧接口雖已成功地用于極性和難揮發物質的分析，但對操作條件卻有很高的要求。CF-FAB克服了TSP 的一些缺陷，但設備上的要求又使這項技術的應用受到限制。電噴霧接口是在常溫常壓下離子從液相直接被引入，而大氣壓化學電離（APCI）的樣品離子是經過化學電離產生的，離解過程對溫度控制的要求不像TSP-MS那么嚴格，在同樣的汽化條件下可用于更多化合物的分析。ESI過程取決于溶液的化學性質、待分析離子的電遷移和表面行為。與ESI相反，APCI過程則取決于氣相的化學性質，如：氣體的酸堿性〔13〕。在質譜中所采用的接口技術受樣品極性的影響。隨樣品極性從非極性至離子型逐漸增加，按如下順序采用相應的質譜接口：氣相色譜（GC）、PB、TSP、APCI和ESI。APCI有較寬的使用范圍，從非極性到離子型化合物都可分析〔14〕。
　
　新的接口技術和離子化方法的發展使HPLC-MS在分析化學上起著不可替代的作用。植物類天然產物成分復雜，甚至含有多達幾千種組分，但往往只是一種化合物和植物的藥效或毒性有關，因而在分離植物萃取物中的活性組分時，希望檢測技術能為色譜峰提供盡可能多的定性信息。質譜技術部分地滿足了這種需要。
　
　前面已經提到，人參皂甙是人參萃取物中的活性組分，由于它缺少發色團，限制了紫外檢測器的應用。1995年Van Breemen等〔15〕采用電噴霧離子化法，將LC-MS技術用于分析人參粗提物中的人參皂甙。基于分子離子峰和基準物的保留時間等信息，未經衍生的人參皂甙Rg1、Re、Rd、Rc、Rb2和Rb1直接被檢測出來。Chuang等用紫外和電噴霧質譜（ESI-MS）檢測，測定黃連中的7種生物堿〔16〕。通過追蹤選定的離子來解決重疊峰問題，用誘導碰撞分解反應獲得單個組分的結構信息。50 min內分離測定了黃連粗提物中的Berberstine、黃連堿、小檗堿、巴馬亭、藥根堿、表小檗堿和非洲防己堿。Wada 等〔17〕用LC-APSI-MS測定了日本烏頭中的生物堿。另有報道〔18〕用TSP-MS分析銀杏中的銀杏苦內酯，檢測限可達1 ng，靈敏度可以和GC-MS相媲美。Gobbato等〔19〕為了克服紫外檢測選擇性低，二極管陣列檢測對結構類似的雙黃酮分辨不清等缺陷，用HPLC-TSP-MS分析了銀杏提取物中的雙黃酮。zui近，Brolis等用HPLC-二極管陣列檢測（DAD），HPLC-TSP-MS和HPLC-ESI-MS檢測，在一個反相大孔C18柱上分析了連翹中黃酮類、萘蒽酮類、間苯三酚類等16種組分〔20〕。

2.3　計算機模擬優化
　
　在分離復雜的混合物時，計算機模擬優化正在發揮著越來越重要的作用。DryLab是一個商品計算機軟件，能夠快速、系統地開發HPLC方法的專家系統。僅僅依靠兩次預實驗，便可得到有關色譜條件的大量信息。此軟件已被廣泛用于各種樣品的HPLC分析方法的開發，如核酸、蛋白質及復雜的天然產物等〔21〕。Metzger等〔22〕用DryLab軟件輔助優化，從而確定了*的梯度時間、陡度、洗脫液的pH、柱類型、流速程序等，對番瀉果和葉中的17個蒽醌類化合物進行了分離測定。在兩次預實驗的基礎上，一個常規控制銀杏質量的HPLC分析方法的開發僅用了8 h，預測的可靠性令人滿意，預測值和實驗值之間的平均標準偏差小于0.4%〔23〕。另外，借鑒已有的分析黃酮的實驗條件，Dzido用DryLab優化了分析蜀葵屬植物中的黃酮類的梯度洗脫方法〔24〕。本實驗室用DryLab開發了HPLC測定大黃中羥基蒽醌類化合物的方法。在優化條件下，對比了不同產地大黃中有效成份的差異，并考察了樣品制備方法對提取效率的影響〔25〕。

2.4　其它
　
　由于中藥劑型的復雜多樣，識別中藥中的摻假物對于質檢部門來說無疑是一個很大的挑戰。商用系統REMEDI HS已被用于檢查中藥中人工合成的中性堿性摻假物〔2〕。這個系統包括一個在線樣品凈化裝置和一個含有555個藥物和代謝物的數據庫。在消費者提供的五種中草藥中苯甲二氮、利眠寧、sulpiride、etenzamide、*和胃復安等合成藥物被識別出來。