ELISA - 方法類型和操作步驟

來(lái)源：上海基免實(shí)業(yè)有限公司 2014年01月02日 14:40

      ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。該法適于測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿及組織液中的樣本，干擾小可以測(cè)到每毫升納克水平的細(xì)胞因子（或受體）的水平。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標(biāo)記的抗原或抗體，③酶作用的底物。

根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。

（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法，

      （二）雙位點(diǎn)一步法在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步（圖15-5）。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。

      在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

      （三）間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體zui常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。

      本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。

（四）競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。
      （五）捕獲法測(cè)IgM抗體血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。

      （六）應(yīng)用親和素和*的ELISA親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)*分子親密結(jié)合。現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。*（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，*－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成*化的產(chǎn)物。親和素與*的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)*分子的結(jié)合位置，可以連接更多的*化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和*與ELIS偶聯(lián)起來(lái)，就可大提高ELISA的敏感度。

      親和素－*系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大。可以在固相上先預(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與*結(jié)合，通過(guò)親和素－*反應(yīng)而使*化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用*化的抗體替代，然后連接親和素－酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號(hào)。

      ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗(yàn). 在這種方法中，通常標(biāo)準(zhǔn)配體是固定的，通過(guò)加入溶液相受體或蛋白質(zhì)來(lái)使之成鍵. 通過(guò)加入與受體特異性反應(yīng)的抗體來(lái)定量成鍵的受體，而且zui初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測(cè)量. 第二種抗體能識(shí)別抗體的末端，在其末端的堿性磷酸酯或過(guò)氧化物酶等與酶發(fā)生反應(yīng)，從而使溶液顯色.

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