• <del id="qqie6"><sup id="qqie6"></sup></del>
  • <tfoot id="qqie6"></tfoot>
  • <ul id="qqie6"></ul>
  • 北京百奧創新科技有限公司
    初級會員 | 第8年

    15522676233,13366620421

    化學試劑
    AdVnt
    vmrd
    Serochem
    Affymetrix
    Agela Technologies
    Ahram Biosystems
    AIM Biotech
    MRC Holland
    Alba Bioscience
    aldevron
    Ambion全國代理
    Advanced Cell Diagnostics
    Ace Glass
    Acris
    AcroBiosystems
    American Screening
    Bio-Gene
    TLC PharmaChem
    vacuubrand
    Valley Biomedical
    vasQtec
    VistaLab
    Visual Protein
    Vitatex
    vivantis
    Vysis
    Xenometrix
    3Helix
    Ab Peptides
    Abaxis
    Abberior
    Abbomax
    ABclonal
    Abgent
    Abiocode
    A-M Systems
    Biohit
    Glycotech
    Antigen America
    chairalix
    InGex
    MyBiosource
    ProQinase
    Atlas Link
    EPC
    Alpco
    Vienna
    Qz biosciences
    Hycult Biotech
    Serion
    Electron Microscopy Sciences
    IQ products
    Affinity
    ProZyme
    Synthose
    Alexis
    Alomone Labs
    NEB
    ChemGenes
    rPeptide
    Alta Diagnostic
    Altromin
    Alzet
    American Diagnostica
    ampolymer
    Acris全國代理
    Acros Organics
    Adámas Nano
    AddexBio
    Ademtech
    ADS Biotec
    Advance Tabco
    Contipro
    Fluidigm
    One Lambda
    XenoTech
    ZenBio
    zsbio
    REPROCELL
    Surmodics
    BioLegend
    DRG
    Echelon
    ProImmune
    ProMab
    G-Bioscience
    ProSci Incorporated
    QED Bioscience
    RAN Biotechnology
    Cytoskeleton
    Aves Labs
    Synaptic Systems
    Aline
    Wako
    Atto-tec
    IMD
    Permagen
    Qiagen
    emfret
    Myriad
    Sciex
    Scripps
    AG Scientific
    Advanced ChemTech
    Aqix
    Arista Biologicals
    Array Bridge
    AscentGene
    Astarte Biologics
    Asuragen
    ATCC
    Atlas Antibodies
    Avantor®
    Avidity
    Cape Cod
    Bioptechs
    biosupply
    Biotest
    BioThema
    Biotools
    BioVectra
    BioVendor
    Biovision
    BlueGene
    Boekel Scientific
    Bovogen Biologicals
    American Elements
    Appolon Bioteck
    數字PCR突變檢測
    熒光定量PCR
    DNA修飾標記探針合成服務
    Starlab
    凝膠遷移實驗(EMSA)
    Western Blot (蛋白印跡)
    FISH熒光原位雜交技術
    實驗技術服務
    流式細胞檢測
    細胞STR鑒定
    細胞凋亡
    細胞端粒酶活性分析
    細胞端粒長度檢測
    細胞免疫熒光
    細胞培養
    細胞遷移能力檢測
    細胞染色體核型分析
    細胞增殖檢測(MTT檢測)
    外周血游離線粒體DNA含量測定
    ATP含量檢測
    線粒體mtDNA拷貝數檢測
    蛋白表達與純化
    蛋白結構研究
    同工酶活性分析
    藥物分析技術服務
    藥物篩選
    藥效毒理分析
    小動物活體成像
    動物實驗項目
    CRISPR-CAS9基因編輯
    生物信息分析
    整體課題外包服務
    Masson染色(膠原纖維染色法)
    甲苯胺藍染色
    ELISA酶聯免疫吸附檢測
    免疫共沉淀
    病理切片以及HE染色
    Alere
    Anadis
    Ancare
    Ancell
    Aniara Diagnostica
    Antibodies Incorporated
    AntibodyChain
    AntiCancer
    Antigenix America
    Aobious
    Chromogenix
    GeneProof
    Kerry
    Decon Labs
    ImmuQuest
    Duran
    Axxora
    Bachem
    Abitec
    ABL,Inc
    ABM
    ABMI
    Abp
    Abways
    accu-chek
    Diagnostics
    Accurate chemical
    Cellscript
    Salimetrics
    Candor
    MasterTech Scientific Incorporated
    Arrayit
    BePure
    BioLumix
    BIOTANG
    Celetrix LLC
    Boston Cellron
    Enquire
    Badrilla授權代理
    bangs授權代理
    BBI授權代理
    BellBrook
    Berthold
    Bertin
    Binitio
    Celex
    Cellagen
    Talen
    CellGenix
    Toxin
    Cell Guidance Systems
    Cell Marque
    CELLTREAT
    Celprogen
    Chem-Impex
    CheMatech
    ChemBridge
    Click chemistry tools
    Cohesion
    Covaris
    CPAchem
    Creative Biogene
    Liposoma
    ChemPep
    Chemsavers
    Chemsigma
    Chimerigen
    Chimerx
    chinese peptide
    Citeq Biologics
    Clare Chemical
    Dianova
    MedKoo
    Diasorin
    Diversified Biotech
    DLD Diagnostics GmbH
    Dual Manufacturing
    Dualsystems Biotech
    Duchefa
    Echemshop
    EdgeBio
    EIAab
    EMP Genetech
    Empire Genomics
    Encorbio
    Enogene
    Envirologix
    Epicentre
    EpiCypher
    Equitech-Bio
    Equl
    Moltox
    Hyglos
    Hypermol
    Hypoxyprobe
    IBA
    ibidi
    ICPbio
    ICT
    Immundex
    Glycan Therapeutics
    Immunology Consultants Laboratory
    Lifeline
    Codex
    DNA Polymerase Technology
    CT International
    EZBioscience
    Cyanotec
    NeoScientific
    Demeditec
    Public Health England
    Expedeon
    Grace Bio-Labs
    GroPep
    Haematologic
    Hampton
    Helena
    Helica
    ESI BIO
    Etonbio
    Eurogentec
    Euroimmun
    EuroProxima
    Everest Biotech
    Exalpha
    Abingdon
    eneka
    Fabgennix
    Favorgen
    FD NeuroTechnologies
    Fermentek
    Firalis
    Fluorochem
    Fortebio
    FST
    Fuji Silysia Chemical
    Gene tools
    Genentech
    Alstem
    Genisphere
    Genovis
    GenScript
    Gentaur
    GenWay
    Gilson
    Glen Research
    ICL
    Inalco SpA
    Inlell
    Instech
    Intellicyt
    Cryogenics
    InvivoChem
    Jai Radhe Sales
    Jena Bioscience
    CliniSciences
    GenTegra
    Isogen
    ECO-TEK
    BioSite
    Anshlabs
    RCA-Separations
    Synchem
    DiaPharma
    OriMAbs
    Tonbo
    WiseGene
    Integral Molecular
    NonInvasive
    Norland
    Novoprotein
    Tecan
    Oxford
    Iwai
    King BioMedical
    LC Sciences全國代理
    lectinity
    LGM Pharma
    Life Diagnostics
    Lumafluo
    Lymphotec
    MatTek
    MCE
    Medical Isotopes
    Meliorum
    MetaSystems
    Microgen
    Micropoint
    Elitech
    molecular devices
    Molecular Dimensions
    Biosearch
    Macrocyclics
    Mypols
    Nacalai Tesque
    nanoComposix
    Nanocs
    Nanolight
    Neogen
    Nexcolm
    Niomech
    Sanbio
    CoaChrom
    Rieke
    Roboz
    Rossix
    SAI
    oetltd
    OlChemIm
    Organotechnie
    Orgentec
    Panagene
    PANATecs
    Panpath
    Poly Scientific
    Polymer Source
    Progen
    Proliant Biologicals
    Quantimetrix
    QuickZyme
    Randox
    Rapidtest
    RD-Biotech
    registech
    Rel Assay Diagnostics
    Relia
    Repligen
    Restek
    RevMAb
    Fujifilm
    ScheBo
    Schott
    SCICONS
    Sekisui
    Sero
    Serva
    Shenandoah
    Scigen
    SignaGen
    Technoclone
    ThermaGenix
    usp
    Signosis
    Silantes
    SkySpring Nanomaterials
    Solvo
    Sarstedt
    Ted Pella
    Stemcell
    DNA提取試劑盒
    Sigma
    Innovative Cell Technologies
    Merck Millipore
    Bio-Rad
    Frontier Specialty Chemicals
    TCI
    Firegen凡知醫療
    Takara

    ELISA的技術要點

    時間:2018/9/20閱讀:379
    分享:

    ELISA的技術要點包括三個方面:試劑的制備、反應條件的選擇和操作的標準化。

      一、試劑的制備

      ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體和與標記酶直接關聯的酶反應底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。

      (一)固相載體

      可作ELISA中載體的物質很多,常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能,抗體或蛋白質抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料,可制成各種形式。在ELISA測定過程中,它作為載體和容器,不參與化學反應。加之它的價格低廉,所以被普遍采用。

      ELISA載體的形狀主要有三種:小試管、小珠和微量反應板。小試管的特點是還能兼作反應的容器,后放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球,表面經磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器,在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗,效果更好。常用的載體為微量反應板,于ELISA測定的產品也稱為ELISA板,通用的標準板形是8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測,有制成8聯或12聯孔條的,放入座架后,大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測,并可在特定的比色計上迅速讀出結果。現在已有多種自動化儀器用于微量反應板型的ELISA檢測,包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟,對操作的標準化極為有利。

      良好的ELISA板應該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別,各種產品的質量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為:以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔后,每孔內加入適當稀釋的酶標抗人IgG抗人IgG抗體,保溫后洗滌,加底物顯色,終止酶反應后分別測每孔溶液的吸光度。控制反應條件,使各讀數在0.8左右。計算所有讀數的平均值。所有單個讀數與平均讀數之差應小于10%。

      與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體,聚氯乙烯板的特點為質軟板薄,可切割,價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值有時也略高。

      為比較不同固相在某一ELISA測定中的優劣,可用以下方法加以檢驗:用其它免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和一個典型的陰性標本。將它們分別進行一系列稀釋后,在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定,然后比較測定結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果判別大,這種載體就是這一ELISA測定的合適的固相載體。

      除塑料制品外,固相酶免疫測定的載體還有兩種材料:一是微孔濾膜,如硝酸纖維素膜、尼龍膜等,這類測定形式將在本章第五節“膜載體的酶免疫測定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的,反應時固相微粒懸浮在溶液中,具有液相反應的速率,反應結束后用磁鐵吸引作為分離的手段,洗滌也十分方便,但需配備特殊的儀器。

      (二)抗原和抗體

      在ELISA實施過程中,抗原和抗體的質量是實驗是否成功的關鍵因素。本法要求所用抗原純度高,抗體效價高、親和力強。

      ELISA所用抗原有三個來源:天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動物組織或體液、微生物培養物等,一般含有多種抗原成分,需經純化,提取出特定的抗原成分后才可應用,因此也稱提純抗原(purifiedantigen)。重組抗原(recombinantantigen)和多肽抗原(peptideantigen)均為人工合成品,使用安全,而且純度高,干擾物質少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術難度且要求較為昂貴的儀器設備和試劑,其應用仍十分普遍,特別是對那些天然抗原不易得到的試驗,更顯出其獨到之處。

      用于ELISA的抗體有多克隆的和單克隆的。抗血清成分復雜,應從中提取IgG才可用于包被固相或酶標記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高,有時可適當稀釋后直接進行包被。制備酶結合物用的抗體的質量往往要求有較高的純度。經硫酸銨鹽析純化的IgG可進一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純特異性IgG,如用酶消化IgG后提取的Fab片段,則效果更好。

      (三)免疫吸附劑

      固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被(coating)。由于載體的不同,包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體,通常將抗原或抗體溶于緩沖液(常用的為pH9.6的碳酸緩沖液)中,加于ELISA板孔中在4℃過夜,經清洗后即可應用。如果包被液中的蛋白質濃度過低,固相載體表面有能被此蛋白質*覆蓋,其后加入的血清標本和酶結合物中的蛋白質也會部分地吸附于固相載體表面,后產生非特異性顯色而導致本底偏高。在這種情況下,如在包被后再用1%~5%牛血清白蛋白包被一次,可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉(blocking)。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時間而不失去其免疫活性。

      (四)酶和底物

      ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應的轉化率高、專一性強、性質穩定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標抗體或抗原性質穩定,繼續保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標本中不存在與標記酶相同的酶。另外它的相應底物應易于制備和保存,價格低廉,有色產物易于測定,光吸收高。ELISA中常用的酶為辣根過氧化酶(HRP)和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶(AP)。

      HRP在蔬菜作物辣根中含量很高,純化方法也不復雜。它是一種糖蛋白,含糖量約18%;分子量為44kD;是一種復合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素)結合而成的一種卟啉蛋白質。主酶為無色糖蛋白,在275nm波長處有zui高吸收峰;輔基是深棕色的含鐵卟啉環,在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP催化下列反應:

      上式中DH2為供氫體,H2O2O為受氫體。HRP對受氫體的專一性很高,除H2O2外,僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體,作為試劑較H2O2方便。許多化合物可作為HRP的供氧體,在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺(orthopenylenediamine,OPD)、四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)]。

      OPD為在ELISA中應用多的底物,靈敏度高,比色方便。其缺點是配成應用液后穩定性差,而且具有致異變性。TMB無此缺點。TMB經酶作用后由無色變藍色,目測對比鮮明;加酸停止酶反應后變黃色,可在比色計中定量;因此應用日見增多。ABTS,雖然靈敏度不如OPD和TMB,但空白值很低。HRP催化OPD的反應如下:

      HRP的純度用RZ(ReinheitZahl,意為純度數)表示,是403nm的吸光度與280nm的吸光度之比,高純度的HRP的RZ≥3.0。應注意的是酶變性后,RZ可不變而活力降低,故重用酶制劑時更重要的指標為活力。酶活力以單位表示:1min將1μmol的底物轉化為產物的酶量為1個單位。

      在ELISA中另一常用的酶為堿性磷酸酶。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD,酶作用的適pH為8.0;用小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kD,適pH為9.6。一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作為底物。它可制成片狀試劑,使用方便。產物為黃色的對硝基酚,在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應后,黃色可穩定一段時間。反應式如下:

      在ELISA中應用AP系統,其敏感性一般高于應用HRP系統,空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑,穩定性較HRP低,價格較HRP高,制備酶結合物時得率較HRP低等原因,國內在ELISA中一般均采用HRP。

      除HRP和AP以外,在商品ELISA試劑中應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-D半乳糖苷(4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside),經酶水解后產生熒光物質4-甲基傘酮(4-mehtylumbelliferone),可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應用可產生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點是需要熒光計測定,而且如用固相載體直接作為測定容器,此載體不可發出熒光。脲酶的特點是酶作用后反應液發生pH改變,可使指示劑變色;另外,在人體內沒有內源酶(酶的化學發光底物見第十八章)。

      (五)結合物

      酶標記的抗原或抗體稱為結合物(conjugate)。抗原由于化學結構不同,可用不同的方法與酶結合。如為蛋白質抗原,基本上可參考抗體酶標記的方法。制備抗體酶結合物的方法通常有以下幾種。

      1.戊二醛交聯法戊二醛是一種雙功能團試劑,可以使酶與蛋白質或其他抗原的氨基通過它而偶聯。戊二醛交聯可用一步法(如連接AP),也可用二步法(如連接HRP)。舉例如下:

      2~5mg純抗體與5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸緩沖液1ml中,4℃下對同上緩沖液透析平衡。磁力攪拌下,緩慢加入1%戊二醛0.05ml,在室溫下放置2小時。在4℃下對0.05mol/LpH8.0Tris緩沖液透析平衡,即得酶標抗體。

      辣根過氧化物酶可溶解于50%飽和度硫酸銨中。用上法交聯后可用50%飽和度硫酸銨沉淀酶標抗體,棄去上清中游離酶。

      戊二醛一步法操作簡便、有效,而且重復性好。缺點是交聯時分子間的比例不嚴格,大小也不一,影響效果。

      制備HRP抗體結合物也可用二步法,即先將HRP與戊二醛作用,透析除去戊二醛,在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標抗體。此法的效率可高于一步法10倍左右。

      2.過dian酸鹽氧化法本法只用于HRP的交聯。該酶含18%碳水化合物,過dian酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用peng氫化鈉(NaBH4)中和多余的過dian酸。酶上的醛根很活潑,可與蛋白質結合,形成an摩爾比例結合的酶標結合物。有人認為此法為辣根過氧化物酶交聯有效的方法。但也有只認為由于所用試劑較為劇烈,各批實驗結果不易重復。

      按以上方法制備的結合物一般混有未結合的酶和抗體。理論上結合物中混有游離酶不影響ELISA中后的酶活性測定,因經過洗滌,非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原,因而減低結合到固相上的酶標抗體量。因此制備的結合物應予以純化。純化的方法較多,分離大分子混合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法操作簡便,但效果不如用SephadexG-200凝膠過濾的好。

      二、適工作濃度的選擇

      在建立某一ELISA測定中,應對包被抗原或抗體的濃度和酶標抗原或抗體的濃度予以選擇,以達到合適的測定條件和節省測定費用。下面以間接法測抗體和夾心法測抗原為例,介紹適工作濃度的選擇方法。

      (一)間接法測抗體

      1.酶標抗抗體工作濃度的選擇

      (1)用100ng/ml人IgG進行包被,洗滌。

      (2)將酶標抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中,保溫、洗滌。

      (3)加底物顯色。加酸終止反應后,讀取吸光度(A),繪制曲線如圖15-10。讀取A值在1.0時的酶標抗體稀釋度,作為酶標抗體的工作濃度。該酶標抗人IgG的工作濃度應為1/1600。

      2.棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度

      (1)用包被液將抗原作一系列稀釋后進行包被,洗滌。

      (2)將強陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋,加樣,保溫,洗滌。

      (3)加按工作濃度稀釋的酶標抗人IgG抗體,保溫,洗滌。

      (4)加底物顯色。加酸終止反應后讀取A值。

      (5)選擇強陽性參考血清的A值為0.8左右、陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀釋度作為工作濃度。表15-1為本例的測定結果,表中數字為A值。從表中可見1:200為zui舒適的工作濃度。

    表15-1 間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇

    各類血清 抗原稀釋度
    1:50 1:100 1:200 1:400 1:800
    強陽性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42
    弱陽性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19
    陰性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.05
    稀釋液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.04

      (二)夾心法測抗原

      在夾心法ELISA法中可用棋盤滴定法同時選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度,舉例如下(表15-2):

    表15-2 夾心ELISA包被抗體和酶標抗體工作濃度的選擇

    包被抗體的濃度及酶標抗體稀釋度 參考抗原
    強陽性(25ng/ml) 弱陽性(1.5ng/ml) 陰性
    10μg/ml      
    1:1000 1.17 0.15 0.09
    1:5000 0.46 0.03 0
    1:25000 0.12 0 0
    1μg/ml      
    1:1000 >2 0.25 0.10
    1:5000 0.91 0.12 0.01
    1:25000 0.25 0.01 0
    0.1μg/ml      
    1:1000 0.42 0.13 0.13
    1:5000 0.11 0.03 0.02
    1:25000 0.03 0 0

      (1)抗體免疫球蛋白用包被緩沖液稀釋至蛋白濃度為10、1和0.1μg/ml,分別在ELISA板上進行包被,每一濃度包括三個縱行,洗滌。

      (2)在一個橫行各包被孔中加入強陽性抗原液,另一橫行加入弱陽性抗原液,第三橫行加入陰性對照液,保溫,洗滌。

      (3)將酶標抗體用稀釋液稀釋成三個濃度,例如1:1000、1:5000和1:25000。分別加入每一包被濃度的一個縱行中,保溫,洗滌。

      (4)加底物顯色。加酸終止反應后,讀取A值。

      (5)以強陽性抗原的A值在0.8左右、陰性參考的A值小于0.1的條件作適條件,據此選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度。從表15-2可看出包被抗體濃度可選用1μg/ml,酶標抗體的稀釋度可選為1:5000。為了進一步節省試劑,可以此濃度為基點,縮小間距再做進一步的棋盤滴定。

      三、測定方法的標準化

      要使ELISA測定得到準確的結果,不論是定性的還是定量的,必須嚴格按照規定的方法制備試劑和實施測定。主要試劑的制備要點已如前述,其他一般性試劑,如包被緩沖液、洗滌液、標本稀釋液、結合物稀釋液、底物工作液和酶反應終止液等,配制時不可掉以輕心。緩沖液可于冰箱中短期保存,使用前應觀察是否變質。蒸餾水的質量在ELISA中也至關重要,使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。

      測定的實施中,應力求各個步驟操作的標準化,下面以板式ELISA為例,介紹有關注意事項。

      (一)加樣

      在ELISA中除了包被外,一般需進行45加樣。在定性測定中有時不強調加樣量的準確性,例如規定為加樣一滴。此時應該使用相同口徑的滴管,保持準確的加樣姿勢,使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應力求準確。標本和結合物的稀釋液應按規定配制。加樣時應將液體加在孔底,避免加在孔壁上部,并注意不可出現氣泡。

      (二)保溫

      在ELISA中一般有二次抗原抗體反應,即加標本后和加結合物后,此時反應的溫度和時間應按規定的要求,保溫容器是水浴箱,可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應疊在一起。為避免蒸發,板上應加蓋,或將板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的,傳熱容易。如用保溫箱,空濕盒應預先放在其中,以平衡溫度,這在室溫較低時更為重要。加入底物后,反應的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于20℃,ELISA板可避光放在實驗臺上,以便不時觀察,待對照管顯色適當時,即可終止酶反應。

      (三)洗滌

      洗滌在ELISA過程中不是反應聚,但卻是決定實驗成敗的關鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯待塑料對蛋白質的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA測定的反應過程中應盡量避免非特異性吸附,而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。在標本和結合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯(吐溫,Tween)一類物質即右達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯,為非離子型的表面張力物質,常作為助溶劑。根據脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號,結合月桂酸的為聚山梨酯20,在ELISA中為常用。它的洗滌效果好,并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。

      洗滌如不*,特別在后一次,如有酶結合物的非特異性吸附,將使空白值升高。另外,在間接法中如血清標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈,也將與酶標抗體作用而產生干擾。

      ELISA板的洗滌一般可采用以下方法:①吸干孔內反應液;②將洗滌液注滿板孔;③放置2min,略作搖動;④吸干孔內液,也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數一般為3~4次,有時甚至需洗5~6次。

      (四)比色

      如陰性對照顏色極淺,在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計測定結果,準確性決定于ELISA板底的平整與透明度和比色計的質量。

    會員登錄

    ×

    請輸入賬號

    請輸入密碼

    =

    請輸驗證碼

    收藏該商鋪

    X
    該信息已收藏!
    標簽:
    保存成功

    (空格分隔,最多3個,單個標簽最多10個字符)

    常用:

    提示

    X
    您的留言已提交成功!我們將在第一時間回復您~
    撥打電話
    在線留言
    主站蜘蛛池模板: 亚洲成人免费在线观看| 久久精品成人一区二区三区| 国产成人福利在线视频播放尤物| 成人h动漫精品一区二区无码| 成人无码精品1区2区3区免费看| 成人在线免费视频| 四虎成人精品无码永久在线| 97色婷婷成人综合在线观看| 成人性生交大片免费看| 国产成人一区二区动漫精品| 久久国产成人精品国产成人亚洲| 成人免费视频试看120秒| 久艾草国产成人综合在线视频 | 91成人免费在线视频| 欧美成人精品一区二三区在线观看| 成人无码免费一区二区三区| 免看**毛片一片成人不卡| 在线免费成人网| 成人免费观看视频高清视频| 久久亚洲精品成人无码网站| 成人免费的性色视频| 欧美成人精品一区二三区在线观看 | 久久成人无码国产免费播放| 成人区人妻精品一区二区不卡网站| 亚洲国产成人久久| 国产成人v爽在线免播放观看| 欧美成人三级一区二区在线观看| 亚洲国产精品成人久久| 免费观看一级成人毛片| 国产精品香蕉成人网在线观看| 欧美成人免费一区二区| 色老头成人免费综合视频| 久久久久亚洲精品成人网小说 | 青青草成人影视| 久久久久亚洲av成人网人人软件 | 成人污视频在线观看| 日韩成人一区ftp在线播放| 欧美激情一区二区三区成人| 色偷偷成人网免费视频男人的天堂 | 婷婷国产成人精品视频| 成人免费在线视频网站|