蛋白酶抑制劑計數及活力測定

一、 蛋白酶抑制劑在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。
在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。
用臺盼蘭染細胞，死細胞著色，活細胞不著色，從而可以區分死細胞與活細胞。利用細胞內某些酶與特定的試劑發生顯色反應，也可測定細胞相對數和相對活力。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計數板、試管、吸管、酶標儀（或分光光度計）
2、試劑：0.4％臺盼蘭，0.5％四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇
3、材料：細胞懸液
三、操作步驟
（一）細胞計數
1、將血球計數板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數板上。
2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。
3、靜置3分鐘。
4、鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：
細胞數/ml＝4大格細胞總數/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個以上蛋白酶抑制劑組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。
（二）細胞活力
1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。
2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。
3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。
死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。
活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。
（三）MTT法測細胞相對數和相對活力
活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周圍。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。
l、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成懸液。
3、37℃下保溫2小時。
4、加入4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。
5、1000 rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色，酸化異丙醇調零點。
注意：MTT法只能測定蛋白酶抑制劑相對數和相對活力，不能測定細胞數。