細(xì)胞分離技術(shù)

一、細(xì)胞培養(yǎng)將組織塊分離（散）成細(xì)胞懸液的方法有多種，常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法。
從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是酶解聚。細(xì)胞暴露在酶中的時間要盡可能的短，以保持大的活性。下列步驟可以解聚整個組織，獲得較高產(chǎn)量的有活性細(xì)胞。
1、* (Trypsin)
在去除不需要的組織后，使用無菌的*和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的*中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。
將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25％溶解在無鈣鎂的*中的*（100mg組織加入1ml *）。
在4℃孵育6到18小時，使幾乎沒有*活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。
移棄組織碎片中的*，在37℃孵育包含殘留*的組織碎片20到30分鐘。
在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基，要加入大豆*抑制劑。
通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200mm）過濾，分散所有剩余組織。計數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。
2、膠原酶 (Collagenase)
用無菌*和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。
加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。
在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。
通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。
通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。
再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。
3、Dispase
用無菌*和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用不含鈣鎂的*清洗組織碎片幾次。加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的*）在37℃孵育20分鐘到幾個小時。
通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞培養(yǎng)、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。通過離心在*中清洗懸液幾次。再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。
二、從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞:以下是從基層迅速分離細(xì)胞，且保持細(xì)胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細(xì)胞系的廣泛應(yīng)用，每一種系統(tǒng)條件和施用濃度應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗加以確定。再次培養(yǎng)時檢測細(xì)胞的活性。細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90％對于無血清培養(yǎng)基，降低*使用量。
1、移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。
2、使用不包含有鈣鎂的*或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細(xì)胞（看表確定正確的清洗溶液）。在培養(yǎng)瓶對著細(xì)胞的一面加入清洗溶液，通過轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層，然后去除清洗液。
3、以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養(yǎng)瓶對著細(xì)胞的一面。確保分離液覆蓋細(xì)胞層。在37℃孵育培養(yǎng)瓶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶。通常，在5到15分鐘內(nèi)，細(xì)胞就會脫落。細(xì)胞分離需要的時間因細(xì)胞系不同而有所變化。仔細(xì)監(jiān)測細(xì)胞分離過程，避免細(xì)胞受損傷。對難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細(xì)胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。
4、當(dāng)細(xì)胞*分離時，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基，通過移液管在單層細(xì)胞表面反復(fù)吹打來分散細(xì)胞培養(yǎng)。計數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。
5、對于無血清培養(yǎng)基，加入大豆*抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml*抑制劑到*中將抑制*活性。