細(xì)胞凋亡檢測方法

1 細(xì)胞凋亡檢測光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

(1) 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。

貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

(2) 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割

成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。

2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細(xì)胞凋亡檢測核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。

常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。

DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。

結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased)，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

3 透射電子顯微鏡觀察

結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡檢測體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象(cavitations)的空泡結(jié)構(gòu)(圖2);Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。