微生物菌種保藏方法

                                                    微生物菌種保藏方法

菌種保藏方法
低溫斜面保藏法
把待保藏的菌種接在適合其生長的培養基上，在合適的條件下培養，待培養基上的單菌落或孢子生長充分后，于２～８℃ 的條件下進行保存，并每隔１～ ２個月傳代接種一次，但是需要注意的是菌種的保藏時間及溫度因微生物的種類不同而不同， 如霉菌、放線菌等保藏２～４ 個月需傳代１次，細菌每月傳代１次。
此法是國內外常用的保存方法之一，適用菌系范圍比較 廣，簡單易行，便于操作和觀察，成本比較低，很是適合工業生產的菌種保存；但是不適宜*保存，長時間保存的話培養基很易失水，而使孢子失去活性，而且斜面、平板低溫保藏必須經常傳代，轉代接種過程中易發生變異、污染雜菌、發生差錯。因此，斜面、平板低溫保藏法適合短期保存常用菌種，應該與*的菌種保藏方法相結合，以防菌系丟失。
半固體穿刺保藏法
配制半固體培養基，高壓濕熱滅菌后倒于無菌 試管中至約1/3，待培養基凝固，用接種環從平面培養基上挑取單菌落，穿入培養基若干次。在合適的條件下進行培養至菌體旺盛生長，之后密封試管， 根據菌種特點在4℃左右或者涼爽干燥處保存。保存時間至少可以達到1年，對于有些菌種甚至能達到20年之久。
方法優缺點:此方法主要適用于工程大腸桿菌等細菌，操作簡便，保存時間較長，適用于實驗室使用，保存時注意培養基的營養不宜過于豐富，以進一步降低細菌的代謝。此法也可以用石蠟對培養基進行液封從而延長保藏時間。
甘油保藏法
先將甘油裝于三角瓶中，塞上棉塞并用牛皮紙包裹滅菌，然后放入無菌間內備用，使用前先將甘油做無菌檢查。在超凈工作臺內，將滅 菌后的甘油直接倒入長好孢子的斜面或者平板內，用量以高出斜面頂端0.5cm為宜，使菌種與空氣隔絕，然后在棉塞外包上牛皮紙，將試管直立置于－80℃的冰箱中保藏
方法優缺點:此保藏方法較斜面、平板低溫保藏法保藏時間長，而且制作簡單，不需經常移種，但保藏時必須直立放置，所占空間較大，也不便于攜帶。且接種時因為甘油太濃稠不宜刮下孢子。
甘油乳糖保藏法
配置甘油乳糖溶液，其實含甘油10％ ，含乳糖20％ ；裝于三角瓶中滅菌，然后放入無菌間內備用，使用前先將甘油乳糖溶液做無菌檢查。在超凈工作臺內，用無菌移液管吸 取適量的甘油乳糖溶液加入到長好孢子的斜面內，用無菌接種鏟刮下孢子分裝于５ml規格的甘油管內，每支管油管裝量３ml，蓋嚴蓋子，做好標記直立放于甘油管盒內，然后放置于- 80℃的冰箱中保藏。
方法優缺點:此種保藏方法可以保存２年左右，保存時間較長，實用的 菌系范圍也比較廣泛，成本比較低，而且在操作過程中簡單易行，在以后的工作中不光是可以用于傳代，而且可以直接用于 搖瓶的接種，比較方便，是工業生產中常用的保存方法之一。
沙土管保藏法
取河沙過40～60目篩去粗粒后，用磁鐵反復吸取鐵屑，然后用10％ 鹽酸浸泡2 ～ 4ｈ 以除去有機質，倒去酸水后用純化水反復沖洗至中性，烘干備用。另取非耕作層的不含腐殖質的瘦黃土，用純化水浸泡使其呈中性，然后烘 干、碾碎過100目篩。將處理好的沙與土以１:１ 混勻， 分裝于小試管內，每管裝1.5ｇ 左右，塞上棉塞，用牛皮紙包好滅菌，滅菌后進行無菌檢驗，合格后使用。將培養成熟的優良菌種（一般指孢子層 生長豐滿的菌種）用無菌接種鏟刮下孢子放入到沙土管中，塞好棉塞放入盛有干燥劑的真空干燥器內，用真空泵抽干水分。 抽真空時間一般為2～ 4小時為宜，以免孢子萌發。抽干的沙土管用無菌勺子搗松并每個種抽?。敝Щ亟佑谛泵媾囵B基上， 進行培養，觀察生長情況和有無雜菌生長。若經檢查沒有問 題，則將制備好的沙土管用牛皮紙包裹好棉塞放于干燥器中保存。
這種方法適用于能產生孢子的微生物，如霉菌、 放線菌，因此在抗生素工業生產中應用廣。保藏效果亦較好，可以達到2年左右。但是此法對于營養細胞效果不好。操作的時候應該注意抽干一步務必要快，盡量在12 h內完成，防止孢子萌發，降低保藏效果。
液體石蠟保藏法
將無菌干燥的液體石蠟注入上述培養好的斜面至高于斜面頂端1cm處，再將試管密封，直立于4℃左右冷藏保存，具體保存溫度隨菌種而變。注意要定期添 加石蠟保證斜面處于液面以下。保藏時間至少可以達到1年。
方法優缺點 液體石蠟保藏法基本上克服了斜面低溫保藏法 保存時間短的缺點，然而液體石蠟保藏法由于要試管直立保存，因此比較耗費空間，不便于攜帶。此法要注意以下兩點：①石蠟要保證無水，干熱160℃， 2 h滅菌后的石蠟可直接使用，若是用高壓濕熱 121℃，20min滅菌法滅菌，則要置于烘箱中至水分蒸發，石蠟液體變澄清后再使用；②用接種環取種復蘇時，注意接種環要充分冷卻防止液體石蠟飛 濺傷人圓。
冷凍真空干燥
將處于成熟期的微生物培養物(若微生物可以產生孢子，則應該盡量使微生物大量產生孢子)懸浮于無菌的血清、卵白、脫脂奶或者海藻糖等保護劑中制成濃菌液，分裝到無菌的安瓿瓶中，于低溫冰箱中冷凍，達到預定溫度后對濃菌液進行冷凍干燥處理， 之后在真空狀態下融封安瓿瓶，然后在冷藏或室溫下保存。
冷凍真空干燥法雖然操作復雜，需要使用冷凍 干燥以及抽真空的設備，然而一旦保存好，則可以小程度地減少微生物的改變、死亡和泄露擴散， 因此適用于大批量菌種的*保存，特別是一些致病微生物的保存。該法是各種保存方法中為有效的方法之一，對于大多數微生物都適用。
液態氮超低溫保藏法
液態氮超低溫保藏法 液氮超過低溫保藏法是把菌種裝在含有冷凍保護劑的安瓿瓶內，將該安瓿瓶放入液氮（-196℃）中進行保藏，由于菌絲體處于-196℃，其代謝降低到*停止的狀態。所以不需定期移植。液氮超低溫保藏法是菌種*保藏的有效可靠的方法。
保護劑：每管加進0.8 毫升高壓滅菌的10%甘油 水溶液或10%二甲亞砜水溶液可作為冷凍保護劑。用無菌鑷子將這種帶有菌絲體的瓊脂塊移入加有保護劑的安瓿管中。用火焰將安瓿管上部熔封，浸在水中檢查有無漏氣。