今天跟大家分享的是Orbitrap Exploris™ 480的第1篇文獻，作者是來自丹麥哥本哈根大學的Jesper V. Olsen教授，文中對Exploris 480聯合FAIMS Pro的性能進行了全面測試，包括DDA與DIA鑒定，靈敏度測試，組織樣品測試，磷酸化樣品測試，以及TMT與DIA定量等。

文獻總結：

• DDA-FAIMS：單個FAIMS CV電壓，500ng Hela 肽段，21分鐘梯度可鑒定3473個蛋白；
• DIA-FAIMS：單個FAIMS CV電壓，500ng Hela 肽段，每分鐘可鑒定2500條unique肽段，配合21分鐘短梯度每天可分析60個樣品，且每個樣品定量超過5000個蛋白；
• 靈敏度測試：5分鐘梯度，5ng Hela肽段中鑒定超過1000個蛋白；
• 組織特異性蛋白分析：12種大鼠組織樣品中TMT及DIA定量超過10000個蛋白；
• 快速、靈敏、深度的磷酸化蛋白質組。

緊湊型四極桿-Orbitrap質譜儀

相比其它二合一的儀器，Exploris 480儀器是一個更緊湊更穩健的平臺，且更易維護。該儀器與三合一系列中的Fusion Lumos及Eclipse有相同的離子源、接口，以及用戶界面，因此可使用與三合一相同的前端選配件，包括FAIMS Pro接口以及內標校正EASY-IC源。同時，Exploris 480中的主動離子傳輸組件、四極桿、獨立的電荷檢測器以及多級離子通道組件均進行了全新的設計升級，提升儀器性能（圖1）。

圖1 Orbitrap Exploris™ 480儀器硬件示意圖

DDA-FAIMS深度蛋白鑒定

擴大動態范圍

樣品：500ng Hela肽段

梯度：21分鐘（60個樣品每天）

鑒定結果：CV電壓在-35V~-80V間，蛋白鑒定數目均高于不使用FAIMS，其中-75V時zui高，可鑒定3473個蛋白，比不使用FAIMS高出38%（圖2A）。

圖2A ：21min梯度，500ng樣品，不同CV電壓時DDA-FAIMS以及DDA的蛋白鑒定

動態范圍：與不使用FAIMS相比，DDA-FAIMS不僅可覆蓋更多的蛋白，還可覆蓋更深的Hela蛋白豐度分布，即更高的動態范圍（圖2B）。

圖2B：DDA-FAIMS及DDA與Hela深度蛋白組的蛋白豐度分布疊加圖

梯度影響：與不使用FAIMS相比，隨著梯度的縮短，-75V CV時的優勢更加明顯。采用100個和200個樣品每天的梯度時，分別增加41%和48%的蛋白鑒定數目（圖2C）。由于文中采用的梯度均很短，而CV電壓的切換需要25ms，因此單個CV電壓條件zui為合適。當梯度延長時，可通過不同CV電壓組合的方式進一步提高蛋白組覆蓋。

圖2C：不同梯度時DDA-FAIMS與DDA的蛋白鑒定對比

DIA-FAIMS進一步擴大蛋白深度鑒定，增加蛋白定量精度

樣品：500ng Hela肽段

梯度：21分鐘（60個樣品每天）

鑒定結果：DIA-FAIMS的*CV電壓為-45V，可鑒定5138個蛋白，蛋白與肽段鑒定數目均高于不使用FAIMS時（圖3A），每分鐘zui高可鑒定2500條肽段（圖3B）。

圖3A：21min梯度，500ng樣品，不同CV電壓時DIA-FAIMS以及DIA的蛋白鑒定；B：梯度中不同時間的肽段鑒定數目

定量精度：使用FAIMS時，71%的蛋白豐度在多次重復間CV值小于20%，54%的蛋白豐度CV值小于10%。而不使用FAIMS時，只有60%的蛋白豐度在多次重復間CV小于20%（圖3C）。

圖3C：DIA-FAIMS與DIA的多次重復蛋白豐度CV對比

極少量樣品時的靈敏度測試

樣品：5ng Hela肽段

梯度：5分鐘（200個樣品每天）

DDA結果：DDA只鑒定到26個蛋白，DDA-FAIMS實現10倍提升至281個蛋白（圖4A）。DDA-FAIMS相比DDA更適用于極少量樣品的分析，這是由于FAIMS可有效去除單價態的背景信號（圖4C）。

DIA結果：DIA可鑒定547個蛋白，DIA-FAIMS可鑒定超過1000個蛋白（圖4A），且FAIMS可提升DIA的定量重現性（圖4B）。

圖4A：5min梯度，5ng樣品在不同方法下的蛋白鑒定數目；B：DIA與DIA-FAIMS方法中重復間蛋白豐度CV小于20%的蛋白數目；C：DDA與DDA-FAIMS時的單價態母離子分布對比

組織特異性蛋白定量分析

樣品：來源于12種大鼠組織的酶解肽段（圖5A）

圖5A：大鼠組織特異性圖譜工作流

梯度：21分鐘（60個樣品每天）

組織特異性蛋白圖譜：每個組織所含肽段各有不同，從骨骼肌中可鑒定50000條unique肽段，到睪wan組織中可鑒定到100000條肽段代表超過10000個蛋白（圖5B，C）。該數據集含有213000條unique肽段，覆蓋12909個蛋白編碼基因，可用于進一步數據挖掘以及作為DIA的譜圖庫。

圖5B：不同組織中的肽段鑒定數目；C：不同組織中的蛋白鑒定數目

TMT-11定量：數據采集使用Turbo-TMT方法，可在15000分辨率下分析TMT11標的樣品。每次實驗代表一只大鼠，均可定量超過8000個蛋白，總共定量超過10000個蛋白（圖6A）。

DIA定量：不同組織分別進行數據采集，用對應組織的譜圖庫進行數據分析。蛋白組在不同組織間存在特異性，在睪wan組織中可鑒定超過5000個蛋白，肌肉組織中能鑒定約2000個蛋白。合并不同組織結果可定量超過8000個蛋白，與TMT的覆蓋率類似（圖6A），且每分鐘可鑒定超過600個蛋白（圖6B）。

圖6A：組織樣品中DIA與TMT的蛋白及蛋白編碼基因PCG的定量數目；B：兩種方法每分鐘定量的PCG數目

生物樣品的重現性分析：分別使用TMT與DIA的數據對三個生物學重復進行主成分分析PCA。三個生物學重復在PCA圖中距離接近，且小于不同組織之間的距離，這說明兩種定量方式在生物重復間都具有高重現性（圖6C，D）。

圖6C：DIA定量的PCA結果；D：TMT定量的PCA結果

無監督層次聚類分析：DIA-FAIMS與TMT所得的蛋白表達譜十分類似，這說明這兩種定量方法可提供類似的生物學信息（圖6E）。

圖6E：兩種方法定量結果的無監督層次聚類結果

快速、靈敏、深度的磷酸化蛋白質組

樣品：200μg Hela肽段經磷酸化富集，12個組織樣品酶解肽段經磷酸化富集

梯度：21分鐘（60個樣品每天）

Hela樣品：21分鐘可鑒定超過8000條unique磷酸化肽段，其中超過5000條可靠定位至單個氨基酸上（圖7A）。

圖7A：200 μg Hela肽段經磷酸化富集后鑒定及定位的磷酸化肽段

組織樣品：采用directDIA的方式，在12個組織樣品中共鑒定到超過22000條unique磷酸化肽段，定位超過13000條磷酸化肽段（圖7B）。

圖7B：12個組織樣品酶解肽段經磷酸化富集后鑒定及定位的磷酸化肽段

總結

• Exploris 480聯合FAIMS Pro適用于蛋白組學的各個方面，除了文中提到的DDA與DIA鑒定，極低量樣品分析，組織樣品，磷酸化樣品，以及TMT與DIA定量等，還可實現BOXCAR-DDA，BOXCAR-DIA，SureQuant等定量工作
• FAIMS可有效去除單價態的背景信號，可提高蛋白組覆蓋，擴大動態范圍，提高定量精度和準確性
• TMTpro（TMT16標）將進一步提高TMT定量通量

全文鏈接

A Compact Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS InterfaceImproves Proteome Coverage in Short LC Gradients

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