蝦白尾?。╓TD）RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（MrNV）說(shuō)明書(shū)

1、蝦白尾?。╓TD）RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（MrNV）簡(jiǎn)介 
貨號(hào)：HB-810-3 
蝦白尾病（White tail disease，WTD）也稱(chēng)為白肌肉?。╓hite muscle disease，WMD）或羅
氏沼蝦肌肉白濁?。∕acrobrachium rosenbergii Whitish muscle disease）,主要在亞洲和南美洲
北部流行。其主要病原為羅氏沼蝦野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV），
研究發(fā)現(xiàn)感染對(duì)蝦中還存在另外一種超小型病毒（Extra small virus，XSV），為 MrNV 的微型病毒。
蝦感染后腹部、尾部出現(xiàn)白色渾濁，Z終可擴(kuò)散全身肌肉，死亡率可達(dá) 95%以上。
為了適應(yīng)蝦白尾病快速檢測(cè)和疫病研究的需要，本公司參考國(guó)家質(zhì)檢總局發(fā)布的《白尾病檢疫
技術(shù)規(guī)范》（SN/T 3583-2013）中*的的引物和探針序列，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)優(yōu)化，開(kāi)發(fā)生產(chǎn)了
本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛和高通
量檢測(cè)等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。
2、 試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸擴(kuò)增試劑。具體組成參見(jiàn)表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積 
*： 核酸裂解液 15ml×2 管
核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水
WTD-MrNV RT-PCR 反應(yīng)液
酶混合物
陰性對(duì)照
WTD-MrNV 陽(yáng)性對(duì)照
1ml×1 管
750µL×1 管
60µL×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
（注：*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》） 
3、 樣本采集,存放及運(yùn)輸 
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。隨機(jī)取5只-10只新鮮的蝦作為采樣標(biāo)本，采
集的部位包括：蝦頭部的鰓絲、肝胰腺、淋巴器官或血淋巴等組織（可部分或全部采集這些組織）。
對(duì)于仔蝦或稚蝦，取整只蝦或蝦頭作為樣品；蝦糞便直接勻漿待檢。詳見(jiàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。
3.2 存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24 h；-70 ℃以下可*保存，但應(yīng)避
免反復(fù)凍融（Z多凍融 3 次）。
3.3 運(yùn)輸：采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。
4、 RT-PCR 檢測(cè) 
4.1 RNA 核酸提取操作方法 
4.1.1 取 n 個(gè)滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品與陰性對(duì)照的和（陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照直接作為 PCR 檢測(cè)的模板，無(wú)需提
取核酸)
4.1.2 每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對(duì)照各 200 ?L，一份樣本換用一個(gè)吸頭，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過(guò)于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛
倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。
4.1.3 蝦白尾病（WTD）RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（MrNV）取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預(yù)冷），做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取 500?L，不能吸出
中間層，顛倒混勻。
4.1.4 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心
倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 ?L 75％
乙醇，顛倒洗滌。
4.1.5 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心
倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。
4.1.6 4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開(kāi)口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液
體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個(gè)吸頭，吸頭不要碰到有
沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過(guò)于干燥，以免 RNA 不溶。
4.1.7 加入 11 ?L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)溆谩?br />提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。
【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說(shuō)明書(shū)》（貨號(hào)：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取
核酸】。
注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需*保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。 
4.2 RT-PCR 檢測(cè) 
4.2.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的 RT-PCR 反應(yīng)液、酶混合物，在室溫下融化后，2000 r/min 離心 5 s。每
個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)表 2：
表 2 每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制表
試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 酶混合物
用量 15 μL 1.0 μL
4.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：
向每個(gè)PCR管空中各分裝15ul的混合液，再分別加入上述樣本處理步驟4.1.7中制備的RNA溶液各
10 ?L，蓋緊管蓋，500 r/min離心30 s。
4.2.3 RT-PCR 檢測(cè)（在檢測(cè)區(qū)進(jìn)行）：
*階段：42 o
C /30 min；
第二階段：95oC /2 min；
第三階段：94 oC /40 sec, 55 oC /40 sec，72 oC /1 min，35個(gè)循環(huán)；
第四階段：72 oC /10 min; 
第五階段：4 oC 保存
4.3 瓊脂糖電泳 
用電泳緩沖液制備 1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好沒(méi)過(guò)膠
面，向 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 1/6 體積的電泳上樣緩沖液（6X 上樣緩沖液），按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立 DNA DL2000 Marker 做對(duì)照。5 V/cm 電泳約 0.5h，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)一定位置時(shí)停止。
在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀(guān)察是否擴(kuò)增出預(yù)期的特異性 DNA 電泳帶，拍攝并記錄。
5、結(jié)果判定 
5.1 RT-PCR 后，陽(yáng)性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)一條 425 bp 的 DNA 片段。陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有該核酸帶。
5.2 蝦白尾?。╓TD）RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（MrNV）待測(cè)樣品 PCR 擴(kuò)增后能在相應(yīng) 425 bp DNA 位置上有帶，可判為 MrNV 核酸陽(yáng)性。