B95-8；絨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟

B95-8；絨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟：
細(xì)胞名稱：B95-8    EB病毒轉(zhuǎn)化的絨猴淋巴細(xì)胞
組織來(lái)源：外周血淋巴細(xì)胞
培養(yǎng)條件：RPMI-1640+10% FBS
形      態(tài)：懸浮；淋巴母細(xì)胞
細(xì)胞培養(yǎng)步驟
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1） 準(zhǔn)備培養(yǎng)基；北美胎牛血清，10%；雙抗1%。
2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
二． B95-8細(xì)胞處理：
1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
1. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若B95-8細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
2. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
3. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
B95-8；絨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
      1．細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml*，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml*培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
      2．1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至zui終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。
3．將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
注意事項(xiàng)：
1.        收到B95-8細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們。
2.        先不開(kāi)瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置數(shù)小時(shí)（4h左右），穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，切忌在溫箱內(nèi)靜置過(guò)夜。
3.        靜置后鏡檢，拍照，記錄細(xì)胞狀態(tài)。建議傳代后也拍照記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
4.      貼壁細(xì)胞：若細(xì)胞密度超過(guò)80%，可正常傳代；若未超過(guò)80%，收集細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，留8ml繼續(xù)培養(yǎng)至80%左右再傳代，瓶蓋可稍微擰松。
5.        細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基含血清和雙抗，可收集后4℃保存?zhèn)溆茫裳a(bǔ)加2%血清。剛開(kāi)始傳代時(shí)建議一半用細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，一半用客戶自備的培養(yǎng)基，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件，以免因不適應(yīng)而造成生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。
6.        細(xì)胞*消化液建議使用PBS配制，
7.        因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程外因太多，所以我們的售后保障期為一周，超過(guò)一周的細(xì)胞我們會(huì)酌情處理，但不提供免費(fèi)更換服務(wù)。
B95-8；絨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細(xì)胞運(yùn)輸和保存：可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式：（1）干冰運(yùn)輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮凍存或直接復(fù)蘇；（2）存活細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長(zhǎng)，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟。