干細胞不貼壁的原因和解決方法

干細胞培養(yǎng)過程中容易出現這樣或那樣的問題，這些問題都是在細胞生長方面來說，比如細胞的不貼壁、生長緩慢、生長不好，甚至死亡的原因，這些問題使得細胞研究者很是頭疼，下面是針對這些問題的原因和解決方法：
一、培養(yǎng)細胞不貼壁
可能原因： 
1.*消化過度 ；
2.支原體污染 ；
3.培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO3分解）；               
4.細胞老化 ；
5.接種細胞起始濃度太低或太高 。
解決方法： 
1.縮短*消化時間或降低*濃度； 
2.分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現支原體污染，丟棄培養(yǎng)物；
3.使用無菌醋酸溶液調整pH值或充入無菌CO2 ；
4.啟用新的保種細胞 ；
5.調節(jié)接種細胞濃度。
二、懸浮細胞成簇
可能原因： 
1.培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子 ；
2.支原體污染；
3.蛋白酶過度消化使得細胞裂解；
4.DNA污染 。
解決方法： 
1.用無鈣鎂*洗滌細胞，輕巧吹吸細胞獲得單細胞懸液；
2.分離培養(yǎng)物，檢測支原體；
3.用DNaseI處理細胞。
三、培養(yǎng)細胞生長緩慢
可能原因：
1.由于更換不同培養(yǎng)液或血清； 
2.培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如*或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞； 
3.培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染； 
4.試劑保存不當； 
5.接種細胞起始濃度太低； 
6.細胞已老化； 
7.支原體污染 。
解決方法： 
1.比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗，讓細胞逐漸適應新培養(yǎng)液； 
2.換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補加*及生長因子；
3.用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現污染，丟棄培養(yǎng)物；
4.血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內用完；
1.增加接種細胞起始濃度； 
2.換用新的保種細胞； 
3.分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。
四、培養(yǎng)細胞生長不好
可能原因：
1.細胞本身的狀態(tài)
細胞傳代次數多，細胞老化；
細胞的接種量：接種量過低，細胞生長緩慢；
細胞傳代時間過晚：細胞中毒，影響傳代后的細胞生長；
*消化時間過長或過短：時間過長，細胞死亡；時間過短，細胞未*分離而成團，細胞死亡；
細胞的凍存與復蘇：慢凍速融。
2.污染
支原體污染；
霉菌污染。
3.培養(yǎng)基或血清
更換血清或培養(yǎng)基之前未進行驗證；
選擇的培養(yǎng)基是否合適；
培養(yǎng)基配制是否準確無誤。
4.培養(yǎng)環(huán)境
CO2供應是否正常；
培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確。
解決方法：
根據以上四個方面的可能原因，做出針對性的解決方案
1.注意細胞的本身狀態(tài)：如傳代次數、接種量等；
2.避免產生污染（用正規(guī)、合法、可溯源的血清）；
3.要用合適的血清或培養(yǎng)基，經過驗證；
4.注意實驗室的環(huán)境。
五、培養(yǎng)干細胞死亡
可能原因： 
1.培養(yǎng)箱內無CO2； 
2.培養(yǎng)箱內溫度波動太大； 
3.細胞凍存或復蘇過程中損傷； 
4.培養(yǎng)液滲透壓不正確； 
5.培養(yǎng)液中有毒代謝產物堆積 。
解決方法： 
1.檢測培養(yǎng)箱內CO2； 
2.檢查培養(yǎng)箱內溫度； 
3.取新的保存細胞種； 
4.檢測培養(yǎng)液滲透壓； 
5.換入新鮮培養(yǎng)液。
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