（一）ELISA試劑盒(酶聯(lián)免疫剖析試劑盒)前史：
ELISA試劑盒自從60-70時代面世以來，得到*科研作業(yè)者的認(rèn)可及推崇，在歐美及我國獲得很大的推行，尤其是國內(nèi)生化領(lǐng)域的長足發(fā)展。 Elisa生物試驗是一種敏感性高，特異性強，重復(fù)性好的試驗確診方法。由于其試劑安穩(wěn)、易保存，操作簡潔，成果判別較客觀等要素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)查驗的各領(lǐng)域中。ELISA試劑盒可檢測樣本：體液、血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液、組織勻漿、心房水標(biāo)本等等。ELISA試劑盒在國內(nèi)有許多種叫法：例如：ELISA檢測試劑盒、ELISA Kit、酶聯(lián)免疫試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、酶聯(lián)免疫剖析試劑盒、酶免試劑盒等，比較常見的叫法是ELISA檢測試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒等。
（二）科研ELISA試劑盒操作怎么讓ELISA體系更安穩(wěn)：
ELISA檢測體系可謂是免疫學(xué)反響應(yīng)用到科研出產(chǎn)中zui為活絡(luò)的技術(shù)手段。但是在新老手操作過程中總是會呈現(xiàn)或大或小的問題，本人在剛開始做ELISA時就面對許多困難，雖然有師兄師姐鋪路，但仍是常常做得烏煙瘴氣，比方說花板，假陽性，全顯色，悉數(shù)顯色，顯色比空白還低,自己也為此苦惱過很長一段時刻，跟著自己技術(shù)水平得進步，或多或少地也把握了ELISA體系的脾氣，也是游刃有余吧，現(xiàn)在做方陣，做ELISA已是駕輕就熟了，曾經(jīng)檢測一種抗體用整整一下午還算得暈暈的，現(xiàn)在給我十個八個的從包被到顯色，一個作業(yè)日根本搞定。下面就由我拋磚引玉地來說一下，做ELISA的經(jīng)驗總結(jié):
1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這到你做出的抗體可不能夠被其辨認(rèn)，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴(yán)厲正告我必定要在冰浴下緩慢消融就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白，關(guān)于*和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，我把方法扼要的列出如下:①親和素*:先親和素先包被載體，參加*化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴展應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。②脂類物質(zhì):可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后參加ELISA板孔中，開蓋置冰箱guo ye或涼風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)天然干固在固相外表。③小分子有必要依托和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。
2、包被液的挑選，一般挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需求，包被原的特殊性也可能選用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)留意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體外表的疏水基團間的效果，這種物理吸附對錯特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)一般含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體外表。具體的試驗還要有鞏固的理論外也要實踐，看一下終究可不能夠應(yīng)用到自己試驗當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才說到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、關(guān)閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。關(guān)閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空地，從而排擠ELISA后的過程中攪擾物質(zhì)的再吸附。常用關(guān)閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉，能夠高濃度運用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(首要為了掃除類似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。但終究選用什么，要依據(jù)試驗具體來實踐。
4、洗刷板：能夠說在ELISA操作中，洗刷是zui首要的關(guān)鍵技術(shù)。由于聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為達到別離游離的和結(jié)合的酶符號物的意圖，鏟除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的攪擾物質(zhì)，在洗刷時又應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來。所以在洗板時會有必定差錯，人為要素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機在外)，洗的不*或串了孔，對如此活絡(luò)的ELISA體系但是不小的影響。
5、加抗體標(biāo)本(和二抗):留意該換槍頭時換槍頭。標(biāo)本稀釋一般可用pbs稀釋，也可用關(guān)閉液去稀釋。如需加二抗，還要留意二抗的作業(yè)濃度，太低則上色淺。
6、顯色:顯色體系又許多，我們一開始做的時分，要挑選適合的顯色體系。留意顯色體系酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉。
7、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好，如呈現(xiàn)問題也好剖析。
（三）相關(guān)常識：
1、問：做直接Elisa法測試小鼠血清中的IgE抗體，設(shè)空白對照、和陰性對照、陽性血清稀釋倍數(shù)為5千、1萬、10萬、20萬不等，用的是*符號的羊抗鼠IgE抗體，和親和素的辣根過氧化物酶。但是成果除了空白對照孔沒有色彩外，其他各孔全有色彩，而且OD值都相差不大，為什么?
答復(fù)：可能原因如下：
(1) 水質(zhì)被金屬離子等污染;避免方法盡量運用新鮮水或蒸餾水。
(2) 洗刷不充沛，樣品中其它成分殘留或酶殘留;避免方法洗刷液應(yīng)注滿微孔，充沛洗刷。
(3) 移液頭重復(fù)運用，未洗凈或消毒不*; 避免方法移液頭一次性運用。
(4) 酶標(biāo)板活絡(luò)度過高。
(5) 一抗顯色時刻的操控等等，關(guān)于ELISA的每一步都要留意才行。
2、ELISA加樣時的防錯小經(jīng)驗
(1)用一張寫滿字的紙，字越多越好，比方報紙，墊在下面，這樣，加過標(biāo)本的小孔看過去下面的字會變小，沒加的字正常，十分簡單區(qū)別。
(2)能夠使用液面反光與沒有加的孔加以差異
(3)在標(biāo)本加完后，再把加樣槍全壓下，使液面發(fā)生小氣泡，也能夠加以區(qū)別
3、棋盤試驗的操作方法:
(1)將抗原按必定的梯度倍比稀釋后，依照ELISA從上到下(或許從左到右)的順序包被。
(2)將抗體按必定的梯度倍比稀釋后依照ELISA從左到右或許從上到下參加。
(3)二抗的稀釋倍數(shù)是必定的，然后顯色，讀值。
ELISA試劑盒OD值的測守時，波長要依據(jù)顯色劑的不同而定，一般上我們都運用TMB顯色，450nm讀值。依據(jù)讀值得成果能夠選定適宜的抗原和抗體效價，這就是棋盤 試驗的意圖，如果抗原包被量已知而二抗的作業(yè)濃度不確定的話就用一抗和二抗作棋盤試驗。
