ATCC細胞培養操作步驟

 隨著分子生物學和ATCC細胞生物學的發展，細胞水平的研究日益受到重視。體外培養的心肌細胞可保存其結構及功能上的某些特點，具有自發性搏動，可在不受神經、體液因素的影響下，直接進行心肌細胞的生理、病理、藥理、毒理及能量代謝等方面的研究以及從培養的心肌細胞中提取有價值的生物因子，心肌細胞培養有著廣闊的應用前景。根據Simpon的方法并稍加改進培養乳鼠心肌細胞敘述如下：

1. 將胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的濃度，并放置于 37℃水浴中溫育好。

2. 解剖取材：將乳鼠放入 0.1%新潔爾滅浸泡一下后拿出，用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露，右手取一把眼科直剪剪開皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨。這樣只要左手稍頂，乳鼠的心臟就直接跳出來。然后用眼科彎鑷從心臟中部直接將心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。重復以上過程。取材完畢后，撤掉取材的手術器械。注：為了保證心肌細胞的活力，取心的操作過程盡量快，另外，把盛的心臟的培養皿放置在冰臺上或者預冷的平衡鹽液中。

3. 用第二套手術器械進行下列操作。用眼科直鑷和眼科彎剪把培養皿中的心臟周邊的血凝塊及纖維組織剔除掉，放在另一個預先裝好D-Hank's液的培養皿中，把心臟組織再洗一遍后，將心臟組織放在另外一個培養皿中，加少許 0.06%胰酶，用眼科彎剪將心臟組織剪成 1mm3大小的碎塊，將剪碎的心臟和胰酶液轉入加了攪拌子的錐形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉入錐形瓶中，補加胰酶至終體積10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中，調節轉速至 60 rpm左右，消化15 min(務必保證水浴溫度恒定在 37℃，并且消化時間不超過 15 min)。或者，如果采用的是水浴震蕩器的話，不用加攪拌子，直接放在水浴震蕩器中消化亦可，轉速和消化時間相同。

4 . 從水浴中取出錐形瓶，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細胞和成纖維類細胞。

5 . 加入10 ml 新的胰酶，用一支新的吸管吹打溶液幾次，機械分散細胞(組織消化后會成為粘稠的膠體狀)，注意：不要過分吹打，否則會導致組織過度消化，37℃水浴攪拌再消化 10-15 min；如果乳鼠數目少(比如 5、6 只的時候)，消化時間可以減少為 5-10 min，否則很容易消化過度。上述消化處理的同時，往一支 50 ml 的一次性無菌離心管中加入 20 ml 預冷的含 10%血清的培養液，并放置冰臺上。消化處理之后，小心移出上清轉至上述加有培養液的離心管中，*次消化收集的分離出的細胞，*次消化結束后；繼續第二次消化，余下的組織塊加入 10 ml 新胰酶繼續消化。

6 . 重復 2.5 消化步驟，直至剩余少許組織塊為止，一般消化 4-5 次可以消化絕大多數的組織塊(不含棄去消化液的那次)。

7 . 第 1、2 次含細胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網后，一起離心；第 3、4 次含細胞的消化液放在一根離心管中，過 180 目篩網后，一起離心。Z后，分別用 8 ml含 20%血清的培養液重懸兩管細胞，接種到一個 75 cm2的塑料培養瓶中，放置在培養箱中 1.5 小時后，取出，棄貼壁細胞(主要是成纖維細胞和內皮細胞)，將未貼壁的細胞懸液取出，臺盼籃拒染法計數后，加入培養液調整細胞濃度為5-6x105個/ml，接種到目的培養器皿中。

8 . 一般不用加BrdU，如果培養時間長(發現成纖維細胞也極少)，可以加入 0.1 mmol/ml BrdU(Sigma)以阻止成纖維細胞增殖。加了BrdU，心肌細胞搏動的持續時間會更長。

9 . ATCC細胞接種后 24 小時，用溫的培養基或者平衡鹽液輕輕沖洗培養的心肌細胞一次，以去處未貼壁的細胞(部分細胞會在 24 小時后貼，結果很多細胞重疊生長)，再更換培養液，即可。可以按照實驗需要在培養 48 h 或 72 h 后施加處理因素。
用于空腸彎曲菌的分離培養    Skirrow Agar Base Modified    250克    空腸彎曲菌瓊脂基礎
用于抗生素敏感試驗    Mueller-Hinton Broth    250    MH 肉湯（MHB）   
用于抗生素敏感試驗    Mueller-Hinton Agar    250    MH 瓊脂（MHA）   
用于抗菌素藥物敏感性試驗    MHB    250克    MH肉湯
用于菌苗及生物制品霉菌無菌檢驗    Martin Broth ,Modified    250    改良馬丁液體培養基   
用于軍團菌的選擇性分離培養(OXOID方法)    BCYE Agar(Legionella Agar)    250    BCYE 瓊脂(Legionella 瓊脂)
用于金黃色葡萄球菌凝固酶試驗    Rabbit  Plasma    0.5ml*20    兔血漿  
用于金黃色葡萄球菌的增菌培養。每100ml培養基需另加入1%亞碲酸鈉1ml    Sodium lurite Broth Base    250    亞碲酸鈉肉湯培養基基礎   
用于金黃色葡萄球菌的增菌培養。每100ml培養基需另加入1%亞碲酸鈉0.2ml    Beisachang Sodium lurite Broth Base    250    北沙參亞碲酸鈉胨水培養基基礎
ATCC細胞