健康原代細胞轉染實驗前準備及步驟

① 從健康原代細胞開始
Ⅰ 轉染實驗前，細胞解凍后傳代3–4次。 這使得細胞從解凍過程中恢復過來，并恢復正常的生長速度。
Ⅱ 僅使用活性 >90%的細胞——使用臺盼藍染色可輕松測定細胞活性。
Ⅲ 定期傳代細胞，切勿讓細胞長到匯合狀態或過度生長。如果讓細胞長到匯合狀態，可能會改變細胞的生長速度以及形態。
a. 請在匯合率達到90%之前對細胞進行傳代。我們建議您使用胰酶替代物Cellstripper™試劑(Corning 25-056-CI)使細胞脫壁。Cellstripper™試劑可于室溫下存儲在通風櫥中。可通過添加過量的Cellstripper™來跳過PBS洗滌的步驟，然后吸棄全部液體，僅留可覆蓋瓶子表面的液體。
* 非酶類細胞分離溶液，其配方是螯合劑的配方，可溫和分離組織培養物的貼壁細胞。性質比胰酶更溫和。
b. 傳代條件取決于所用的細胞系。 部分經驗法則：
對于快速生長的細胞，倍增時間為16小時(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。
對于生長緩慢的細胞，倍增時間為36小時(如原代細胞)，按1：5的比例分瓶。
Ⅳ 保留凍存的細胞系，并定期解凍新細胞。 傳代次(>30–40)時，細胞的生長速度和形態會改變。

② 進行實驗之前，請先規劃您的實驗。
務必要熟悉實驗方案、確定所需的材料量，并在開始實驗前確認所需的一切物品條件均已齊備。
Ⅰ 開始前，設計好鋪板路線圖，標注好每次處理或實驗條件。
Ⅱ 計算所需脂質體和DNA的儲備量，并確認有足夠的下列材料：TransfectGRO減血清培養基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX試劑，以及DNA (0.5–1 µg/µL)。

③ 轉染時，請使用DNA。
Ⅰ 使用無內毒素的試劑盒和實驗方案制備DNA。
Ⅱ 通過測量OD 260/280值來確定DNA純度，測得的OD值應介于1.7–1.9]之間。數值過高或過低均說明有雜質，不宜用于轉染實驗。
Ⅲ 在無DNA/RNA酶的水或TE中稀釋DNA。
Ⅳ 制備的工作濃度為0.5–1 µg/µL。 可用SpeedVac®濃縮儀或透析過濾裝置(例如，Millipore Amicon®超濾管)來濃縮DNA。

④ 轉染當天，將細胞鋪板。
Ⅰ 如果在轉染前一天或更早時間鋪板，轉染效率可能下降。
Ⅱ 轉染時，細胞密度保持在匯合率為70–90%。
Ⅲ 轉染時，細胞密度影響轉染效率。 為了簡化轉染優化過程或節省時間，我們建議細胞鋪成2種不同的密度，以確保較高的轉染效率。
Ⅳ 細胞的鋪板和轉染可同時進行，或者通過反向轉染操作進行。 反向轉染操作中，使用的細胞是正常/正向轉染的2.5倍以上。
Ⅴ 轉染復合物可以加到含抗生素和血清的培養基中，且不會影響轉染效率。

⑤ 準備脂質體-DNA復合物。
Ⅰ 為了獲得試驗結果，我們建議在TransfectGRO培養基中混合脂質體和DNA。 另一種方法是使用無血清培養基。
Ⅱ 在TransfectGRO培養基中稀釋脂質體。 在第二管Opti-MEM®培養基中稀釋DNA，然后和等體積脂質體溶液混合。 該2步稀釋法可獲得更的數據，比脂質體直接加入稀釋的DNA中的方法獲得的結果更有重復性。
Ⅲ 脂質體一旦在TransfectGRO培養基中稀釋，在加入稀釋的DNA之前，孵育時間為2- 5分鐘。 稀釋的脂質體孵育時間不要超過20]分鐘。
Ⅳ DNA的TransfectGRO溶液更加穩定，Z早可以提前4小時制備，但不要太早。
Ⅴ 原代細胞等體積稀釋的脂質體和DNA溶液等體積混在一起后，通過緩慢地上下吹打來混合溶液，也可輕彈試管底部，或者快速渦旋混合。
Ⅵ 脂質體/DNA復合物溫育5-10小時后，將復合物轉移到含有細胞和生長培養基的孔中。 將復合物滴加到培養基上，然后輕輕地晃動板子。 切勿劇烈地將孔中的脂質體/DNA復合物分散，否則會使細胞移位。
130573-200701    50mg    鑒別
130576-200901    50mg    有關物質
130579-200901    100mg    有關物質
130585-201001    100mg    HPLC含量
130593-200901    200mg    HPLC含量
130601-201001    50mg    有關物質
130605-201001    50mg    有關物質
130650-200901    50mg    有關物質
135001-201002    11.9g/400ml    培養基適應性
135002-201002    11.4g/400ml    培養基適應性
135003-201002    9.0g/400ml    培養基適應性
原代細胞