原代細胞凍存和復蘇操作規程

原代細胞培養的傳代及日常維持過程中，在培養器具、培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開活體開始原代培養，它的各種生物特性都將逐漸發生變化并隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。
原理 ：
細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以Z大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。
主體內容（操作步驟）：
一、材料
（一）儀器
1. 凈化工作臺
2. 離心機
3. 恒溫水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
5. 倒置相差顯微鏡
6. 培養箱
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（彎頭、直頭）
2. 培養瓶
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
4. 廢液缸
（三）塑料器皿
1. 吸頭
2. 槍頭
3. 膠塞
4. 移液管（10ml）
5. 15ml離心管
6. 凍存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加樣槍
2. 紅血球計數板
3. 記號筆
4. 醫用橡皮膏
5. 移液槍
（五）試劑
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
3. 培養液
4. 雙抗（青霉素、鏈霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
6. 1NHCl
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析純）或無色新鮮甘油
四、操作步驟
（一）細胞凍存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液；
2. 取對數生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的原代細胞則直接將細胞移至15ml離心管中、；
3. 離心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及舊的培養液，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的Z終密度為5×106/ml～1×107/ml；
5. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；
7. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。
（二） 細胞復蘇
1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。
2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養液，混勻；
3. 離心， 1000rpm，5min；
4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養；
5. 次日更換一次培養液，繼續培養。
五、注意事項
1．從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存，但為對數生長期細胞。在凍存前一天換一次培養液；
2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷；
3．原代細胞凍存和復蘇用新配制的培養液。