內(nèi)氏放線菌PCR檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

內(nèi)氏放線菌PCR檢測(cè)試劑盒說明書

產(chǎn)品名稱：內(nèi)氏放線菌PCR檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格：50T
原理是由一對(duì)引物介導(dǎo)，能在動(dòng)植物體外對(duì)特定基因(DNA)斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增，經(jīng)過n個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0＜E＜1,擴(kuò)增效率＝倍，使得檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)

特異性強(qiáng)

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

②堿基配對(duì)原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
本產(chǎn)品就是根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物而開發(fā)的高靈敏熒光定量 PCR 產(chǎn)品。
具有下列特點(diǎn)：
1.根據(jù) 指標(biāo)的保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
2.靈敏度比常規(guī) PCR 高 2-3 個(gè)數(shù)量級(jí)，可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
3.即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確快速。
4.一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染。
5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
規(guī)格及成分                            成分
 2×qPCR MagicMix                 500 μL（裝 A 袋）
微量核酸稀釋液（熒光 PCR ）1 mL（裝 A 袋）
PCR 引物混合物                        100 μL（裝 A 袋）
基因陽性對(duì)照                           50 μL（裝 B 袋）
DNA 病毒裂解液（試用裝）       15 次（9 mL）
使用手冊(cè)                              1 份
運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸、-20℃保存(A 袋試劑放樣品準(zhǔn)備區(qū)、B 袋的陽性對(duì)照好分開放置)，
自備試劑DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。
應(yīng)用案例
內(nèi)氏放線菌PCR檢測(cè)試劑盒樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的長(zhǎng)為 86bp 的 DNA 段作為陽性對(duì)照。
2.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（好用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號(hào)管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 4 號(hào)管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。8.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。
設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20  μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.在 PCR 管中加入下列成分（待測(cè)樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后Z后加）：
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
10. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行
優(yōu)化）。
過程溫度時(shí)間
預(yù)變性95℃1 分鐘
PCR 反應(yīng)95℃15 秒
（30 個(gè)循環(huán)）60℃15 秒
72℃15 秒
11. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)，
Z大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的Z大吸收光譜在 500 nm，Z大發(fā)射光
譜在 530 nm。
四、數(shù)據(jù)處理
12. 以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品
的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
內(nèi)氏放線菌PCR檢測(cè)試劑盒組成及試劑配制:

1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
注意事項(xiàng)：

1．基礎(chǔ)程序；

2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；

3．反應(yīng)時(shí)間；

4．循環(huán)次數(shù)；

5．PCR 反應(yīng)液的配制；

6．PCR技術(shù)的基本原理；

7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；

8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。   

【儲(chǔ)存條件及有效期】:

-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期6個(gè)月。

【適用儀器】:

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【內(nèi)氏放線菌PCR檢測(cè)試劑盒樣本采集、存放及運(yùn)輸】

u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h，-70℃以下可長(zhǎng)期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（Z多凍融3次）；

u 運(yùn)輸：采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

【自備試劑】:產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)