細胞轉染小貼士

原代細胞轉染目前已經成為研究和控制真核細胞基因表達的重要手段。本文整理了一些關于轉染實驗前的準備工作及一些實驗過程中的小貼士，希望這些信息能夠幫助各位科研君們做好轉染實驗及提高實驗效率。

① 從健康細胞開始
Ⅰ 轉染實驗前，細胞解凍后傳代3–4次。 這使得細胞從解凍過程中恢復過來，并恢復正常的生長速度。
Ⅱ 僅使用活性 >90%的細胞——使用臺盼藍染色可輕松測定細胞活性。
Ⅲ 定期傳代細胞，切勿讓細胞長到匯合狀態或過度生長。如果讓細胞長到匯合狀態，可能會改變細胞的生長速度以及形態。
a. 請在匯合率達到90%之前對細胞進行傳代。我們建議您使用胰酶替代物Cellstripper™試劑(Corning 25-056-CI)使細胞脫壁。Cellstripper™試劑可于室溫下存儲在通風櫥中?？赏ㄟ^添加過量的Cellstripper™來跳過PBS洗滌的步驟，然后吸棄全部液體，僅留可覆蓋瓶子表面的液體。
* 非酶類細胞分離溶液，其配方是螯合劑的配方，可溫和分離組織培養物的貼壁細胞。性質比胰酶更溫和。
b. 傳代條件取決于所用的細胞系。 部分經驗法則：
對于快速生長的細胞，倍增時間為16小時(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。
對于生長緩慢的細胞，倍增時間為36小時(如原代細胞)，按1：5的比例分瓶。
Ⅳ 保留凍存的細胞系，并定期解凍新細胞。 傳代次數高(>30–40)時，細胞的生長速度和形態會改變。

② 進行實驗之前，請先規劃您的實驗。
務必要熟悉實驗方案、確定所需的材料量，并在開始實驗前確認所需的一切物品條件均已齊備。
Ⅰ 開始前，設計好鋪板路線圖，標注好每次處理或實驗條件。
Ⅱ 計算所需脂質體和DNA的儲備量，并確認有足夠的下列材料：TransfectGRO減血清培養基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX試劑，以及DNA (0.5–1 µg/µL)。

③ 轉染時，請使用DNA。
Ⅰ 使用無內毒素的試劑盒和實驗方案制備DNA。
Ⅱ 通過測量OD 260/280值來確定DNA純度，測得的OD值應介于1.7–1.9]之間。數值過高或過低均說明有雜質，不宜用于轉染實驗。
Ⅲ 在無DNA/RNA酶的水或TE中稀釋DNA。
Ⅳ 原代細胞制備的工作濃度為0.5–1 µg/µL。 可用SpeedVac®濃縮儀或透析過濾裝置(例如，Millipore Amicon®超濾管)來濃縮DNA。

④ 轉染當天，將細胞鋪板。
Ⅰ 如果在轉染前一天或更早時間鋪板，轉染效率可能下降。
Ⅱ 轉染時，細胞密度保持在匯合率為70–90%。
Ⅲ 轉染時，細胞密度影響轉染效率。 為了簡化轉染優化過程或節省時間，我們建議細胞鋪成2種不同的密度，以確保較高的轉染效率。
Ⅳ 細胞的鋪板和轉染可同時進行，或者通過反向轉染操作進行。 反向轉染操作中，使用的細胞是正常/正向轉染的2.5倍以上。
Ⅴ 轉染復合物可以加到含抗生素和血清的培養基中，且不會影響轉染效率。

⑤ 準備脂質體-DNA復合物。
Ⅰ 為了獲得的試驗結果，我們建議在TransfectGRO培養基中混合脂質體和DNA。 另一種方法是使用無血清培養基。
Ⅱ 在TransfectGRO培養基中稀釋脂質體。 在第二管Opti-MEM®培養基中稀釋DNA，然后和等體積脂質體溶液混合。 該2步稀釋法可獲得更的數據，比脂質體直接加入稀釋的DNA中的方法獲得的結果更有重復性。
Ⅲ 脂質體一旦在TransfectGRO培養基中稀釋，在加入稀釋的DNA之前，孵育時間為2- 5分鐘。 稀釋的脂質體孵育時間不要超過20]分鐘。
Ⅳ DNA的TransfectGRO溶液更加穩定，Z早可以提前4小時制備，但不要太早。
Ⅴ 等體積稀釋的脂質體和DNA溶液等體積混在一起后，通過緩慢地上下吹打來混合溶液，也可輕彈試管底部，或者快速渦旋混合。
Ⅵ 脂質體/DNA復合物溫育5-10小時后，將復合物轉移到含有細胞和生長培養基的孔中。 將復合物滴加到培養基上，然后輕輕地晃動板子。 切勿劇烈地將孔中的脂質體/DNA復合物分散，否則會使細胞移位。

⑥ 利用含GFP或LacZ之類報告基因的質粒作為陽性對照，評估轉染效率。
利用顯微鏡(例如FLoid™細胞成像工作站)或流式細胞儀(例如Attune®聲波聚焦流式細胞儀)可輕松測定轉染細胞和GFP蛋白表達細胞的百分比。 可使用ToxBLAzer™試劑盒來測定LacZ基因的表達。
Ⅰ 轉染后24-48小時，應該可以看到或檢測到質粒的表達。
Ⅱ 原代細胞陽性對照可以放在一個單獨的孔中，或是與感興趣的質粒共轉染。 共轉染過程中，在加入稀釋的脂質體之前，可在TransfectGRO培養基中將50–100ng帶GFP的質粒和100 ng感興趣的質粒混合。