細胞培養技術注意事項

1.原代細胞實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以 70 % 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。

 3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

 4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺(至少 Class II)。操作過程中，應避免引起aerosol 之產生，小心****，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

 5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2壓力 5.2. CO2 培養箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000 小時/HEPA)。

 6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水

 7. 認真按照操作規程進行實驗，一般不大會導致污染，很多情況下是由于所用的試劑或培養基有污染而使實驗失敗，粉末培養基配制好后(加了血清)，一般在4度盡量不要超過1個月，如在-20度存放時間可長一些，但也不要超過3-4個月，可能對于永生化原代細胞來說要求不是太高，但我在過去的4年里一直是作原代 細胞培養 的，細胞嬌弱，經驗表明放置時間不宜過長。

 8. 許多塑料制品也可以高壓消毒，例如培養瓶蓋，膠塞，吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了，當然如果 money有限，如進口的培養板、皿等，也可以重復使用1-2次，我當時使用方法是將其*清潔后，使用前在紫外燈下敞開照射1-1.5h即可，我做過多次，沒有出現問題。塑料培養瓶由于清洗消毒不便，不要重復使用，如一定要重復用，可用環氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用)

 在光鏡下，上皮細胞通常呈“鋪路石”樣排布，細胞之間有拉絲現象(即距離較遠的細胞可以通過細長的觸手相連)，細胞有成片生長的特性。而間質細胞通常呈梭形，沒有有成片生長的特性，細胞之間的不緊密。但是原代細胞的形態特征會因為生長條件的改變而改變，如HeLa細胞是上皮細胞，但是在酸性培養條件下會變為梭形。