人胚胎干細胞培養技術參數

人胚胎干細胞培養技術參數
1，在T25培養瓶中加入5% Matrigel，搖勻后覆蓋底面即可，于37℃細胞培養箱中至少放置30 min以上。 
2，吸除Matrigel，加入事先水浴加熱至37℃的MEF*培養液。一般地，一個T25培養瓶中加入5 ml MEF*培養液。 
3，按實驗需要復蘇MEF若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。 
4，將凍存管內細胞懸液轉移至含2 ml MEF*培養液的15 ml離心管內，以    1000 rpm，離心5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的MEF*培養液1 ml，重懸后按照一個T25培養瓶鋪1´106的MEF細胞，平均加入到T25 培養瓶，輕輕搖勻后置于37℃細胞培養箱。48h以后可以傳入人胚胎干細胞。 
5，復蘇或傳代hES細胞前，將T25培養瓶中的MEF*培養液吸除，加入2 ml hES*培養液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的hES*培養液待用。 
復蘇： 
1，將hES細胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。 
2，將凍存管內細胞懸液轉移至含3-4 ml hES*培養液的15 ml離心管內，以1000 rpm，離心5 min。 
3，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的hES*培養液2-3 ml，吹打一次使細胞懸浮。 
4，轉移至1個已經鋪好MEF細胞的T25培養瓶中培養。 
5，復蘇第二天不換液，第三天起每天更換hES細胞*培養液。 
注意：復蘇后48小時換液，期間不要挪動細胞。hES復蘇后大約4-5天才開始有克隆出現。 
傳代： 
1，一般在復蘇后第7-10天傳代，正常傳代為7天一次。 
2，吸除廢液。 
3，用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。 
4，加入4-5 ml的1 mg / ml的Collagenase-type IV至培養瓶，輕輕晃動，使之覆蓋底面，置于37℃培養箱內消化細胞。 
5，在顯微鏡下觀察，直至克隆邊緣大部分脫落（一般需要30-60 min）。 
6，用10 ml移液管輕輕吹打，將克隆吹下，細胞懸液轉移至15 ml離心管中，放置一會，待克隆自然沉降后將上層Collagenase-type IV吸除，加入hES*培養液3 ml，放置一會，待克隆自然沉降后將上層培養液吸除。 
7，加入的hES*培養液3 ml，用10 ml移液管吹打2-3次，細胞自然沉降，將上層吹打的過小的克隆及培養液吸除，加入hES*培養液3 ml，懸浮細胞，按照1:4的比例進行傳代。 
8，放入37℃培養箱內培養。 
9，第二天不換液，第三天起每天換液，換液前顯微鏡下將分化的克隆挑除。 
注意：復蘇后48小時換液，期間不要挪動細胞。hES復蘇后大概4-5天才開始有克隆出現。 
凍存： 
1，按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。 
2，細胞自然沉降，吸除上層培養液，逐滴加入已經預冷的凍存液，輕輕懸浮細胞。 
3，按每支凍存管內加入500 ml細胞懸液分裝到凍存管內，標記細胞名稱、代數、凍存日期等基本信息。 
4，將凍存管置于程序降溫盒內，-80℃過夜，轉入液氮。