細胞初代培養技術參數

細胞初代培養技術參數

原理

將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。

儀器、材料及試劑

儀器：培養箱(調整至37℃)，培養瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數板、離心機、水浴箱(37℃)

材料：動物組織塊

試劑：1640培養基(含20%小牛血清)，0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒

初代消化培養法

1. 準備：取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2. 布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。

3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用hanks液漂洗2~3次，去除血污;如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。

4. 剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。

5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。

6. 分離：在消化過程中見消化液發混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速(500~1000轉/分)離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液。

7. 計數：用計數板計數，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養液調整后，分裝入培養瓶中。對大多數細胞來說，pH要求在7.2~7.4范圍，培養液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調整。

8. 培養：置于36.5℃溫箱培養，如用CO2溫箱培養，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。