ATCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟

1、ATCC細(xì)胞傳代

(1)試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。

(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘(37。C，5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞*從壁上脫落下來為止。

(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

(5)用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞*分散開。

(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。

(8)將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。

2、ATCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染

(1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備

A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。

(2)選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。

(3)將混合液在室溫放置10—15分鐘。

(4)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

(5)加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。

(6)到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。

3、第二次ATCC細(xì)胞傳代

(1) 在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

(2) 再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新粉入培養(yǎng)皿中。

(3) 在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。