脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)分析

脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)分析

脂質(zhì)體介導(dǎo)是目前條件下Z方便的轉(zhuǎn)染方法之一，適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞株。

用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對(duì)每批LR都要做：*，先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1～5μg和孵育時(shí)間6小時(shí)開(kāi)始，按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間(2～24小時(shí))。因LR對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過(guò)24小時(shí)為宜。

方法一、操作步驟

1. 取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105 個(gè)液，37℃CO2 培養(yǎng)至40%～60%匯合時(shí)(匯合過(guò)分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。

2. 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR，終量100μL，輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過(guò)高所致，應(yīng)酌情減量)。

3. 轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。

4. 轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6～24小時(shí)，吸除無(wú)血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

5. 其余處理如觀察、篩選、檢測(cè)等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

方法二、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

1. 以5×105 細(xì)胞株/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時(shí)，使其達(dá)到50～60%板底面積。

2. 在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

①在1mL無(wú)血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。

②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置5～10分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。

3. 棄去細(xì)胞中的舊液，用1mL無(wú)血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3～5小時(shí)。

4. 再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14～24小時(shí)，

5. 吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)24～48小時(shí)。

6. 用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

方法三、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

1. 接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長(zhǎng)至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

2. DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前2、3步驟。

3. 在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。

4. 吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞株，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞篩選法進(jìn)行。