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    原代細胞傳代培養法操作注意事項

    時間:2017/1/19閱讀:672
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    原代細胞傳代培養法操作注意事項

    原理

    原代細胞在培養瓶長成致密單層后,已基本上飽和,為使細胞能繼續生長,同時

    也將細胞數量擴大,就必須進行傳代(再培養)。 傳代培養也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以,而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。

    材料和試劑

    1. 細胞:貼壁細胞株

    2. 試劑:0.25%胰酶、1640培養基(含10%小牛血清)

    3. 儀器和器材:倒置顯微鏡,培養箱、培養瓶、吸管、廢液缸等

    原代細胞操作步驟

    1. 吸除培養瓶內舊培養液。

    2. 向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許,以能覆滿瓶底為限。

    3. 置溫箱中2~5分鐘,當發現細胞質回縮,細胞間隙增大后,立即終止消化。

    4. 吸除消化液,向瓶內注入Hanks液數毫升,輕輕轉動培養瓶,把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時,動作要輕,以免把已松動的細胞沖掉流失,如用胰蛋白酶液單獨消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用Hanks液沖洗,直接加入培養液。

    5. 用吸管吸取營養液輕輕反復吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。

    6. 計數板計數后,把細胞懸液分成等份分裝入數個培養瓶中,置溫箱中培養。

    原代細胞無菌操作注意事項

    1. 操作前要洗手,進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。

    2. 點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。

    3. 操作動作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。

    4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。

    5. 瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。

    6. 吸溶液的吸管等不能混用。

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