犬維生素K1（VK1）ELISA檢測試劑盒實驗原理

犬維生素K1（VK1）ELISA檢測試劑盒檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被犬維生素K1（VK1）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的犬維生素K1（VK1）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

酶標儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱
操作注意事項

  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
  實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
  標準品稀釋液即可視為陰性對照或者空白；預處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。
  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
  所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標板

12孔×8條

12孔×4條

無

標準品（160pmol/mL）

0.6mL

0.6mL

按說明書進行稀釋

標準品稀釋液

6mL

3mL

無

樣本稀釋液

6mL

3mL

無

檢測抗體-HRP

10mL

5mL

無

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

犬維生素K1（VK1）ELISA檢測試劑盒按說明書進行稀釋

底物A

6mL

3mL

無

底物B

6mL

3mL

無

終止液

6mL

3mL

無

封板膜

2張

2張

無

說明書

1份

1份

無

自封袋

1個

1個

無

注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：160、80、40、20、10、5 pmol/mL.

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步驟

  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
  待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；
  隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷

 繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

試劑盒性能

1.  準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度：低檢測濃度小于1.0 pmol/mL。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應。

4.  重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  犬維生素K1（VK1）ELISA檢測試劑盒有效期：6個月