豬細小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒實驗原理

豬細小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒

【產品名稱】

商品名稱：豬細小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒

Name ：Porcine Parvovirus (PPV) Probe qPCR Kit

【包裝規格】50 次/盒

【產品及特點】

豬細小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)會引起豬細小病毒病。這是一種豬繁殖

障礙病，該病主要表現為胚胎和胎兒的感染和死亡，特別是初產母豬發生死胎、畸

形胎和木乃伊胎，但母豬本身無明顯的癥狀。豬群暴發此病時常與窩仔數減少、母

豬難產和重復配種等臨床表現有關。在懷孕早期 30-50 天感染，胚胎死亡或被吸

收，使母豬不孕和不規則地反復發情，該病毒會給養豬業帶來巨大的經濟損失，因

此豬細小病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本公司開發豬細

小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經過優化，靈敏性高。

3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據豬細小病毒 DNA 高度保守區設計，不會跟其他微生物 DNA

發生交叉反應。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數

量級

6.本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

7.本產品只能用于科研。

【規格及成分】

成分 包裝

2×Probe qPCR Magic Mix 500 μL（紅蓋）

熒光 PCR 專用模板稀釋液 1 mL（綠蓋）

超純水 1ml（白蓋）

豬細小病毒探針法 qPCR 引物-探針

混合液

150 μL（棕色蓋）

豬細小病毒探針法 qPCR 陽性對照

(1×10E7 拷貝/μL)

50 μL（黃蓋）

使用手冊 1 份

【運輸及保存】

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

【自備試劑】

樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污

染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原 本產品不

提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1.標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭下同）。

3.在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分

鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充

分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充

分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品待提取，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備

陽性對照），和 NC（樣品制備陰性對照）。可以取陽性對照的 1000 倍稀釋液 10

μL 再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規定體積一致，以此作為 PC。另

外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個

用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用

于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其

中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模

板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面

只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完

畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成分/每管

樣品管

N+2 個

PCR 陰

性對照管

標準曲線樣品

管（1-6 管）

2×Probe qPCR Magic Mix 10 μL 10 μL 10 μL

豬細小病毒探針法 qPCR 引物-探針

混合液

3 μL 3 μL 3 μL

N+2 個待測 DNA 模板 7 μL - - 超純水 - 7 μL - 第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液

（1-6 號） - - 7 μL（1 號樣到

1 號管，2 號樣到

2 管…）

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：

過程 溫度 時間

預變性 95℃ 10 min PCR 反應

（45 個循環）

95℃ 15sec 55℃ 30sec 72℃ 40sec（采集 FAM 通道的熒光信號）

四、數據處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值

為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品核酸濃度

的 log 值，再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于

或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等

于 35。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則

為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復實驗的 Ct 值如果大于或等于

40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。