酶免疫檢測(cè)技術(shù)分析方法

酶免疫檢測(cè)技術(shù)分析方法

1．標(biāo)記抗原

(1)全酶標(biāo)記抗原用于測(cè)定小分子化合物的酶有溶菌酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖一6一磷酸脫氫酶等，進(jìn)口原裝elisa試劑盒通過雙功能交聯(lián)劑N一羥基丁二酰亞胺酯與抗原共價(jià)結(jié)合。

(2)輔基標(biāo)記抗原 預(yù)先將葡萄糖氧化酶在酸性條件下水解成葡萄糖氧化酶蛋白和黃素腺嘌呤雙核甘酸(FAD)兩種成分，它們單獨(dú)存在時(shí)無酶活性，但可組成具有酶活性的葡萄糖氧化酶。試驗(yàn)中，先將FAD標(biāo)記到抗原分子上，當(dāng)此標(biāo)記試劑與抗體結(jié)合后，F(xiàn)AD即失去重組能力。

(3)輔酶標(biāo)記抗原這是利用偶聯(lián)酶系統(tǒng)的反復(fù)增幅放大作用能檢測(cè)微量輔酶的特性而建立的一種超敏感方法。

(4)底物標(biāo)記抗原 大都選用口半乳糖苷酶的熒光性底物——4一甲基傘形酮基β-D半乳糖苷(4MUG)標(biāo)記抗原。

2．標(biāo)記抗體

(1)標(biāo)記抗體酶抑制免疫測(cè)定法 常用磷脂酶c與IgG抗體分子經(jīng)水溶性羥化和亞胺共價(jià)交聯(lián)成酶標(biāo)抗體，底物為SRBC(綿羊紅血細(xì)胞)壁中的磷脂物質(zhì)。將待測(cè)樣品、酶標(biāo)抗體和SRBC加在一起．當(dāng)抗原抗體結(jié)合后可抑制標(biāo)記抗體中的酶對(duì)SRBC壁中磷脂的水解能力，SRBC則不發(fā)生溶解。

(2)酶增強(qiáng)免疫測(cè)定法此法需兩種抗體試劑。首先在待測(cè)樣品中加入少量β-半乳糖苷酶標(biāo)記的抗體．經(jīng)抗體、抗原結(jié)合后，加入琥珀酰化的帶過量負(fù)電荷的抗體，與抗原發(fā)生第二次結(jié)合，使其表面的負(fù)電荷大大增強(qiáng)。當(dāng)加入帶正電荷的小分子底物鄰硝基半乳糖吡喃苷時(shí)．由于靜電引力作用，在抗原分子周圍形成大量的酶底物結(jié)合物，經(jīng)比濁(355nm)測(cè)定，可確定抗原含量。

(3)配對(duì)酶雙標(biāo)記系統(tǒng) 配對(duì)酶亦稱偶聯(lián)酶，其中一種酶催化底物產(chǎn)生的物質(zhì)正好是第二種酶的底物。

3．不均相酶免疫試驗(yàn)

不均相酶免疫試驗(yàn)是目前廣泛應(yīng)用的方法。酶結(jié)合物直接與樣品中的抗原、半抗原或抗體進(jìn)行免疫化學(xué)反應(yīng)形成酶免疫復(fù)合物，它與游離的酶結(jié)合物在物質(zhì)上或多或少是相同的．因此需將其分離后．進(jìn)口原裝elisa試劑盒再進(jìn)行酶的活性測(cè)定．并計(jì)算樣品中抗原、半抗原或抗體的含量。

(1)直接法將所選擇的酶通過適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑．與特異抗體球蛋白，與相應(yīng)抗原溫育，然后用該酶的特殊底物，顯示抗原一抗體復(fù)合物的存在。

(2)間接法抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后．用酶標(biāo)記的抗球蛋白溫育，然后用該酶的特殊底物．顯示抗原抗體復(fù)合物的存在。

(3)雙重抗體法將抗原的溶液與含特異性抗體的免疫球蛋白致敏載體表面溫育，洗去過剩的抗原溶液．然后加入酶標(biāo)記的特異性抗體球蛋白，這種酶標(biāo)記的抗體球蛋白吸附到已被致敏的載體表面所結(jié)合的抗體上。溫育后，洗去過剩的酶標(biāo)記抗體球蛋白。使用特殊的底物顯示復(fù)合物的存在。 另外。進(jìn)口原裝elisa試劑盒還有專門檢測(cè)抗原的標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法和不需要使酶與抗體或抗原交聯(lián)的不標(biāo)記抗體酶方法。