PCR反應條件優化

1. 變性：在第一輪循環前,在94℃下變性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不全,往往使PCR 失敗,因為未變性全的DNA 雙鏈會很快復性,減少DNA 產量.一般變性溫度與時間為94℃ 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可全,所耗時間主要是為使反應體系全達到適當的溫度。對于富含GC 的序列,可適當提高變性溫度.但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。

2. 退火：這是PCR 的一個關鍵參數。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm 低5℃, 當產物中包含有影響實驗的非可異性擴增帶時,以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。如果兩個引物Tm 不同，將退火溫度設定為比低的Tm 低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm 設計的退火溫度先進行5 個循環，然后在根據較低Tm 設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高,所得產物的特異性越高。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個擴增循環, 既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數秒鐘即可完成,反應中所需時間主要是為使整個反應體系達到合適的溫度。

3. 延伸：延伸反應通常為72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最適反應溫度75℃.實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為Taq DNA 聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應時間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb 長的DNA。延伸時間過長會導致產物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列, 則可適當增加延伸反應的時間。一般在擴增反應完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應,以獲得盡可能完整的產物, 這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。

4. 循環次數： 當其它參數確定之后, 循環次數主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30輪循環已經足夠。循環次數過多,會使PCR 產物中非特異性產物大量增加。通常經25-30 輪循環擴增后, 反應中Taq DNA 聚合酶已經不足, 如果此時產物量仍不夠, 需要進一步擴增,可將擴增的DNA 樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應底物進行擴增, 這樣經60 輪循環后, 擴增水平可達109-1010。擴增產物的量還與擴增效率有關,擴增產物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。其中：C 為擴增產物量,C0 為起始DNA 量, P 為增效率, n 為循環次數。在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應，減少非特異性產物。