細(xì)胞周期測(cè)定操作步驟

      細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。

     單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測(cè)定細(xì)胞周期的方法。BrdU（5-溴脫氧尿mi啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過(guò)兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。

操作步驟:

1、細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使終濃度為10μg/ml。

2、44小時(shí)加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。

4、常規(guī)染色體制片（見(jiàn)第三部分：染色體技術(shù)）。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。

9、計(jì)算： 細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時(shí)）

附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。

（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。