PCR反應(yīng)靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染解答

  PCR反應(yīng)出現(xiàn)假陽性，一是引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。
二是靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：

1、整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：

1）、操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或濺出離心管外。

2)、除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)一次性使用。

3)、必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。

2、空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。